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    腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌腎臟保護(hù)性生長因子的作用

    2015-03-22 10:47:43張曉鳳陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科西安710003
    陜西中醫(yī) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:傳代含藥生長因子

    張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科(西安 710003)

    腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌腎臟保護(hù)性生長因子的作用

    張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科(西安 710003)

    目的:探討腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)大鼠MSCs分泌腎臟保護(hù)性生長因子HGF、BMP-7的作用。方法:灌胃法制備腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清。采用密度梯度離心法分離和培養(yǎng)大鼠MSCs,取第三代MSCs,分別加入腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清和對(duì)照血清體外對(duì)MSCs進(jìn)行培養(yǎng),至第10d,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)兩組MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行比較。結(jié)果:培養(yǎng)10d后,腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清組培養(yǎng)的MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達(dá)高于對(duì)照組。結(jié)論:腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清可上調(diào)MSCs分泌腎臟保護(hù)性生長因子HGF、BMP-7的表達(dá),從而對(duì)腎間質(zhì)纖維化發(fā)揮修復(fù)作用。

    間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新、多系分化和高度增殖的細(xì)胞,易于分離培養(yǎng)、擴(kuò)增,移植時(shí)不存在組織配型、免疫排斥及倫理等問題,日益成為細(xì)胞移植和組織工程中的理想種子細(xì)胞[1]。MSCs以旁分泌方式分泌多種細(xì)胞因子和生長因子,促進(jìn)周圍細(xì)胞的存活,完成腎小管修復(fù)是其發(fā)揮腎間質(zhì)纖維化治療的主要機(jī)制[2]。MSCs的這種旁分泌作用與中藥復(fù)方配伍治療疾病的作用機(jī)制非常相似。有研究報(bào)道某些益氣活血降濁的中藥復(fù)方和溫陽補(bǔ)腎的中藥單體具有體外促進(jìn)MSCs分泌細(xì)胞因子的作用[3, 4]。益腎散結(jié)法是中醫(yī)治療慢性腎臟病的常用法則, 基于此法則研制的中藥復(fù)方腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是治療腎間質(zhì)纖維化的有效方劑[5]。既往研究表明,腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊可減少腎臟局部轉(zhuǎn)化生長因子β 1(transforming growth factorβ 1,TGF-β1) 和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor1,PAI-1)的表達(dá)。本此利用含藥血清技術(shù)研究腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是否具有體外促進(jìn)MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用,從而探討益腎散結(jié)法與MSCs旁分泌HGF、BMP-7,促進(jìn)腎小管修復(fù)之間的關(guān)系, 為中醫(yī)益腎散結(jié)法治療腎間質(zhì)纖維化提供新的理論依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 材 料 主要儀器與試劑:醫(yī)用超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠),CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國HERA cell公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司),DMEM / F12 1∶1培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),優(yōu)質(zhì)胎牛血清(美國Hyclone公司),胰蛋白酶消化液(美國Sigmar公司),青霉素和鏈霉素(美國Hyclone公司),Real-time PCR 儀(美國,Applied Biosystems 7000),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MSCs取自于2周齡雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓中,經(jīng)體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)。Sprague-Dawley 大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.3 藥 物 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊(菟絲子、丹參、王不留行、鱉甲、僵蠶、山萸肉各12g,金櫻子、淫羊藿、炒杜仲、姜黃、莪術(shù)、赤芍各10g),由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。

    2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 分 組 Wistar大鼠20只, 分為兩組, 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊組和生理鹽水對(duì)照組, 分別灌服腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊溶液(450mg/kg·d)及等體積的生理鹽水,1次/d, 連續(xù)10d。

    2.2 含藥血清及對(duì)照血清的制備 兩組大鼠于末次給藥后1h開胸心尖取血, 2500rpm離心25min,分離血清, 經(jīng)56℃,30min滅活, 0.22μm濾膜過濾滅菌, -30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 MSCs的分離、純化和培養(yǎng) 取2周齡雄性SD大鼠兩只,頸椎脫臼法處死,浸泡于75%乙醇中15min后,置于超凈臺(tái)中;嚴(yán)格無菌條件下將大鼠下肢皮膚去除,股骨于髖臼處離斷,置于無菌培養(yǎng)皿中。剪除軟組織,剔除股部和腿部肌肉后分離出雙側(cè)股骨及脛骨;將分離的股骨和脛骨放于滅菌PBS中,浸泡5min。剪斷股骨、脛骨兩端骨骺露出骨髓腔,用5mL注射器吸引無血清的培養(yǎng)基,沖出骨髓組織,反復(fù)數(shù)次,至骨髓腔發(fā)白,1000rpm,離心5min,棄上清;在細(xì)胞沉淀中加入含10%FBS,1%青、鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基,充分吹打制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后,調(diào)細(xì)胞濃度以2×106/cm2的密度接種于25cm2的塑料培養(yǎng)瓶,置于37℃、5 %CO2飽和度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);接種24h后,首次半量換液,之后每3d換液1次。7~10d后待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí),進(jìn)行傳代。傳代過程如下:棄去培養(yǎng)液后,以37℃預(yù)熱的PBS輕洗兩次,加入含0.25%胰酶的消化液1mL,消化2min后,在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞皺縮變圓部分脫壁后,終止消化。輕吹打細(xì)胞后收集,1000rpm,離心5min,棄上清;加入10mL含15%FBS的培養(yǎng)基重懸,并以1∶2比例分瓶,即為第1代MSCs (passage 1),記為P1,將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4~5d后待細(xì)胞長滿80%時(shí),按以上步驟進(jìn)一步培養(yǎng)傳代。

    2.4 含藥血清對(duì)MSCs的體外旁分泌作用 將待處理的MSCs分別移至放有無菌蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)成單層,再分別加入腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清及對(duì)照血清,每隔48h換液。于第10d作以下檢測(cè):應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)MSCs分泌HGF、BMP-7的表達(dá)。收集血清處理后的各組細(xì)胞,加入1mL Trizol 提取總 RNA,紫光分光光度儀測(cè)定其純度和含量,凝膠電泳檢測(cè)其完整性。合成的引物序列如下:HGF上游引物5AAGAGTGGCATCAAGTGCCAG-3’,下游引物,5’-CTGGATTGCTTGTGAAACACC-3’;BMP-7上游引物,5’-CTCCACAGGTAGCACACATCAC -3’,下游引物,5’-CCACATCCAGAACCAGAGACTT-3’;GAPDH上游引物, 5’-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’,下游引物,5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’??俁NA樣品用隨機(jī)引物按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明合成cDNA 第一鏈,利用Primer-Express (ABI, Foster City, CA)設(shè)計(jì)引物,以其為模板應(yīng)用Prism 7500 real-timePCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)。所用熒光試劑為SYBR-Green,逆轉(zhuǎn)錄cDNA 樣品擴(kuò)增至反應(yīng)結(jié)束。然后以GAPDH 作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定Ct(cycle threshold)值。以目的基因/GAPDH的比值衡量PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

    3 結(jié) 果 3.1 MSCs的分離、純化和培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的MSCs 24h后開始貼壁,形態(tài)不均一,體積較小,或圓形,或多邊形,或梭形,3d后可形成集落(圖1-1);7d時(shí)細(xì)胞呈長梭形。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí),即可進(jìn)行傳代。傳代后的MSCs增殖速度明顯加快,細(xì)胞形態(tài)基本均一,呈紡錘形或長梭形,鋪展?fàn)?,活力好,可見少量未貼壁的雜細(xì)胞。通常情況下,MSCs每5~7d傳代一次,通過換液和傳代的方法可以純化細(xì)胞。第3代MSCs形態(tài)均勻呈成纖維細(xì)胞樣,旋渦狀分布(圖1)。

    A:為P0代MSCs,可見細(xì)胞形態(tài)各異,B:為P3代MSCs,可見細(xì)胞形態(tài)均一,成旋渦狀分布

    圖1 MSCs形態(tài)圖

    3.2 RT-PCR檢測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)MSCs分泌HGF、BMP-7的作用 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清組和生理鹽水對(duì)照血清組分別培養(yǎng)細(xì)胞10d后,經(jīng)PCR法檢測(cè),腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清具有促進(jìn)MSCs分泌抗纖維化因子的作用,藥物作用后的MSCs 分泌的HGF、BMP-7 等細(xì)胞因子表達(dá)明顯上調(diào),組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見表1。

    表1 MSCs的HGF、BMP-7 mRNA的表達(dá)

    組別HGF/GAPDHBMP-7/GAPDH對(duì)照組0.137±0.0050.271±0.010實(shí)驗(yàn)組0.550±0.056△1.506±0.118△

    注:與對(duì)照組比較,△P<0.05

    4 討 論 中醫(yī)益腎、散結(jié)治則是用于治療慢性腎臟病的常用法則, 旨在疏通病變部位的脈絡(luò), 改善局部生存狀態(tài), 與促進(jìn)其分泌HGF、BMP-7,參與局部微環(huán)境的重建有相通之處?;诖朔▌t而研制的腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是臨床治療腎間質(zhì)纖維化的有效方劑。本研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSCs在腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清的誘導(dǎo)下,分泌抗纖維化因子HGF、BMP-7的作用明顯增強(qiáng)。HGF、BMP-7可與受損腎臟中的某些細(xì)胞因子結(jié)合刺激腎組織原位干細(xì)胞和殘余腎小管上皮細(xì)胞完成腎小管修復(fù)作用。因此,我們認(rèn)為,腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清具有體外誘導(dǎo)MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用,為將來協(xié)助MSCs移植治療腎間質(zhì)纖維化提供了可靠的手段和理論依據(jù)。

    [1] Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL,et al. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow[J]. Stem cells (Dayton, Ohio), 2002, 20(3): 249-58.

    [2] Cheng K, Rai P, Plagov A, et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms [J]. Exp Mol Pathol, 2013, 94(3): 466-73.

    [3] 晏子友, 趙 海, 賴小美. 腎衰泄?jié)釡珜?duì)腎間質(zhì)纖維化小鼠HGF、TGFβ-1的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國中醫(yī)藥科技,2007,14(2): 74-75.

    [4] 裴志勇, 趙玉生, 高 偉,等. 地黃低聚糖對(duì)人脂肪組織來源干細(xì)胞旁分泌作用的影響[J]. 中國臨床保健雜志,2012,10(4): 388-391.

    [5] 史 健, 劉建紅, 程小紅,等. 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2012,28(3): 99-101.

    (收稿2014-11-01;修回2014-11-20)

    血管性頭痛/中醫(yī)藥療法 @葛根通絡(luò)湯

    R747.2

    A

    10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.060

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