稻瘟菌激發(fā)子的研究進(jìn)展

余 歡，姜 華，王艷麗，孫國昌

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州310021）

在植物與病原菌互作過程中，激發(fā)子是致病性的關(guān)鍵因素，能促發(fā)植物免疫反應(yīng)和促使病原物侵染［1］.激發(fā)子是病原菌分泌的一類特殊的蛋白質(zhì)，能在植物界面或植物細(xì)胞內(nèi)起作用［2-3］.一些激發(fā)子，即無毒基因分泌的蛋白，能被寄主中相應(yīng)的抗性基因蛋白直接或間接的識(shí)別，觸發(fā)超敏反應(yīng)［4］.

稻瘟病是由稻瘟菌引起的重要病害，嚴(yán)重影響全球糧食產(chǎn)量安全［5］.在我國也屢有大暴發(fā)，重病地區(qū)產(chǎn)量損失達(dá)40%～50%，局部田塊甚至顆粒無收［6］.經(jīng)過多年的研究，抗性品種的選育和大面積推廣被證明是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、最有效和最安全的解決方案［3，6］.但是抗瘟品種連續(xù)使用3～5年后，抗性就會(huì)明顯衰退，原因之一是寄主與稻瘟菌之間的互作［6］.目前，激發(fā)子的研究是國際植物與病原互作領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)［7-9］.因此，研究瘟菌激發(fā)子特別是無毒激發(fā)子，激發(fā)子的侵染機(jī)制以及在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移機(jī)制，有利于研究稻瘟菌與水稻互作機(jī)制，實(shí)現(xiàn)水稻抗病的持久化.

1 稻瘟菌激發(fā)子

關(guān)于稻瘟菌激發(fā)子，有兩種猜測(cè)：大部分激發(fā)子的毒力太低以至于在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中不能檢測(cè)到；激發(fā)子的活動(dòng)是多向的，多個(gè)激發(fā)子參與相同的毒性途徑［10］.目前，已鑒定出15個(gè)稻瘟菌激發(fā)子（表1），其中9個(gè)是AVR 基因產(chǎn)物，能被水稻抗性基因R 產(chǎn)物識(shí)別，觸發(fā)高敏反應(yīng)［8］，4 個(gè)活體營養(yǎng)相關(guān)分泌蛋白（BAS1，BAS2，BAS3，BAS4），以及最近鑒定出來的Slp1和MC69［4，11］.然而，除了Slp1之外，這些激發(fā)子在稻瘟菌中的毒力活性仍是未知的［10］.

1.1 非無毒基因分泌的激發(fā)子

Slp1在真菌細(xì)胞壁和水稻細(xì)胞膜界面積累，能結(jié)合幾丁質(zhì)，阻止幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)；Slp1對(duì)稻瘟菌毒性是必需的，并對(duì)組織侵染和病斑擴(kuò)散表現(xiàn)出強(qiáng)烈的影響［12］.Saitoh等［10］對(duì)稻瘟菌侵染的早期階段的78個(gè)分泌蛋白進(jìn)行大規(guī)模的斷裂分析，鑒定出了基因MC69，編碼54個(gè)氨基酸，N 端含有信號(hào)肽.MC69在稻瘟菌的附著胞侵入和致病性有重要作用，活細(xì)胞成像表明MC69在分生孢子和侵染的所有階段表達(dá)，但并不轉(zhuǎn)移進(jìn)水稻細(xì)胞質(zhì).黃瓜炭疽菌中MC69的缺失使得該病菌對(duì)黃瓜葉片和本氏煙草葉片的致病性減弱.因此，MC69是稻瘟菌侵染單子葉植物和黃瓜炭疽菌侵染雙子葉植物所必須的致病蛋白.然而，MC69的致病性或毒性仍是未知的［10］.對(duì)BSA 進(jìn)行熒光標(biāo)記顯示BSA1-4是以不同的模式分泌進(jìn)入細(xì)胞，BAS1，BAS2隨著無毒基因優(yōu)先在活體營養(yǎng)界面復(fù)合物BIC處積累，然后轉(zhuǎn)移進(jìn)已經(jīng)侵染的水稻細(xì)胞中，甚至移動(dòng)到臨近的未侵染的細(xì)胞中；BAS3位于細(xì)胞壁附近，BAS4圍繞不斷延伸的IH［11］.

1.2 無毒基因分泌的激發(fā)子

在9個(gè)無毒基因編碼的激發(fā)子中，ACE1編碼長4035個(gè)氨基酸的多肽，是聚酮合酶和非核糖體多肽酶的復(fù)合物，這兩種酶都與真菌的次生代謝相關(guān)［13］.突變實(shí)驗(yàn)表明Ace1生物合成活性對(duì)無毒基因是必須的，很可能是稻瘟菌轉(zhuǎn)移進(jìn)水稻細(xì)胞后觸發(fā)高敏反應(yīng)過程中激發(fā)子的產(chǎn)物［13］.Li等［20］通過圖位克隆方法從菌株81278ZB15分離得到無毒基因Avr Piz-t，編碼長108個(gè)氨基酸的分泌蛋白，該蛋白功能未知，在稻瘟菌和其他已測(cè)序的真菌中沒有同源性蛋白.Park等［19］的研究表明AVRPiz-t在轉(zhuǎn)基因水稻中的異位表達(dá)抑制flg22和幾丁質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧以及提高對(duì)稻瘟菌的敏感性，暗示了AVRPiz-t可以抑制PTI信號(hào)途徑；蛋白互作實(shí)驗(yàn)表明AVRPiz-t抑制水稻環(huán)指狀E3泛素連接酶APIP6的活性；并提出一種新的機(jī)制：真菌激發(fā)子通過作用于寄主泛素蛋白酶系統(tǒng)來抑制寄主的PTI信號(hào)途徑.

表1 稻瘟菌激發(fā)子的特征Tab.1 The characteristics of rice blast effector

2 激發(fā)子的分泌

絲狀真菌稻瘟菌可以引起稻瘟病.稻瘟菌侵染寄主時(shí)，孢子先形成一個(gè)專門的侵染結(jié)構(gòu)附著胞，產(chǎn)生巨大的細(xì)胞膨壓穿過植物表皮［5］，形成薄的管狀初始菌絲（PH），初始菌絲隨后膨大形成球根狀的侵染菌絲（IH）［23］.從形態(tài)學(xué)上來看，IH 限制在隔膜連接處，類似人類真菌病原物念珠菌產(chǎn)生的假絲狀真菌［24］.IH 隨后在第一次入侵的細(xì)胞中擴(kuò)展，逐漸占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，然后侵入到鄰近的細(xì)胞中.

對(duì)稻瘟菌分泌機(jī)制進(jìn)行突變分析表明，激發(fā)子進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后存在不同的分泌途徑，例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶LHS1是激發(fā)子的分泌所必需的，該基因發(fā)生突變后在BIC處不能累積激發(fā)子及不能形成Pita介導(dǎo)的HR 反應(yīng)；ATP2可以編碼位于高爾基體的P類型的ATP酶，僅與激發(fā)子的分泌和一些胞外酶有關(guān)，對(duì)缺失該基因的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，激發(fā)子的分泌可能是通過胞吐作用進(jìn)行的［9］.經(jīng)過研究，Giraldo等［14］發(fā)現(xiàn)在稻瘟菌侵入水稻時(shí)，激發(fā)子蛋白的分泌有兩條途徑：質(zhì)外體激發(fā)子包括Bas4，Bas113，Slp1，圍繞IH 在EIHM 上積累，遵循常規(guī)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體分泌途徑，對(duì)BFA 敏感，依賴高爾基體；細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子包括Pwl2，AVR-Pita，Bas1，Bas107也在EIHM 中積累并圍繞初始菌絲和第一次形成的球根狀的IH 細(xì)胞，但不會(huì)圍繞在接下來形成的IH 細(xì)胞，這些細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子遵循非常規(guī)的分泌途徑，對(duì)BFA 不敏感，涉及泡外復(fù)合物和SNARE蛋白.真菌泡外復(fù)合物Exo70和Sec5在稻瘟菌細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子的分泌機(jī)制中起作用，并導(dǎo)致這些激發(fā)子在BIC上的積累，這兩個(gè)復(fù)合物突變后細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子分泌減少，但是在水稻細(xì)胞中仍能觀察到，表明在該分泌系統(tǒng)中出現(xiàn)功能冗余［14］.

Khang等利用活細(xì)胞成像技術(shù)定位了一個(gè)新結(jié)構(gòu)，活體營養(yǎng)界面復(fù)合物（BIC），BIC 的形成分兩個(gè)階段，第一階段與EIHM 膜帽相關(guān)，向初始菌絲和IH 頂點(diǎn)擴(kuò)展；第二階段與初始菌絲分化形成球根狀的IH相關(guān)［8，23］.在稻瘟菌入侵的第一個(gè)水稻細(xì)胞中形成的BIC可以通過其大?。ㄖ睆酱笥?μm）和預(yù)測(cè)的位置（初始菌絲延伸形成的第一個(gè)侵入菌絲的側(cè)面）所確定；而在隨后侵染的水稻細(xì)胞中形成的BIC 只能通過熒光定位［8］.Giraldo等提出證據(jù)表明BIC是由植物衍生出來的界面結(jié)構(gòu)，位于真菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁外富含植物細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的區(qū)域；此外，與BIC相關(guān)的球根狀I(lǐng)H 細(xì)胞分泌細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子，通過BIC，轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞質(zhì).T-SNARESso1在BIC的正常形成中起重要作用，Sso1發(fā)生突變后，在初始菌絲中可以觀察到第二個(gè)類似BIC的結(jié)構(gòu)［14］.在每個(gè)稻瘟菌新侵入的水稻細(xì)胞中，激發(fā)子首先在BIC處積累，當(dāng)IH 在不斷生長至整個(gè)細(xì)胞過程中，激發(fā)子會(huì)繼續(xù)合成并轉(zhuǎn)移到BIC，激發(fā)子在BIC處的優(yōu)先積累與其啟動(dòng)子與信號(hào)肽編碼序列相關(guān)［8］.

3 激發(fā)子在寄主中的轉(zhuǎn)移

植物病原菌，細(xì)菌、真菌、卵菌亞綱通過轉(zhuǎn)移激發(fā)子蛋白進(jìn)入寄主細(xì)胞，引起寄主內(nèi)在的免疫反應(yīng)［25］.細(xì)菌是通過一個(gè)類型III的分泌系統(tǒng)（T3SS）轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞質(zhì)，而真菌和卵菌亞綱的轉(zhuǎn)移機(jī)制雖不清楚，但與細(xì)菌有相似的過程［16，25］.像RXLR 和LXLFLAK 這樣的保守轉(zhuǎn)移基序在卵菌亞綱中已經(jīng)得到鑒定［25-26］.在卵菌亞綱中激發(fā)子的N 端檢測(cè)到高度保守的RXLR 基序，而且存在于所有已知的無毒基因中［27］.在真菌中，轉(zhuǎn)移基序?qū)ぐl(fā)子進(jìn)入細(xì)胞來說是必需和有效的，目前，已被鑒定的有4個(gè)：小麥黃斑葉枯病菌中的Tox A［28］；共生擔(dān)子真菌類雙色蠟?zāi)⒅械腗ISP7［29］；亞麻銹菌中的Avr L567和Avr M［30］.然而，這些結(jié)構(gòu)域沒有任何的序列相似性或結(jié)構(gòu)上的特性［16］.在稻瘟菌中一些激發(fā)子也含有類似Lx AR 基序，但是這些基序在激發(fā)子轉(zhuǎn)移過程中的功能仍然是未知的［19］.

Kang等通過質(zhì)壁分離觀察到PWL2：FPs（圖1A）轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且在臨近的沒有侵染菌絲的水稻細(xì)胞中也觀察到熒光；而BAS4：FPs（圖1B）圍繞侵染菌絲，不轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞中［8］.同樣，活細(xì)胞成像顯示在BIC和水稻細(xì)胞核中均可以看到AVRPiz-t：mCherry：NLS發(fā)出的紅色熒光，但是在臨近的未侵染的水稻細(xì)胞核中沒有觀察到侵染菌絲，這一現(xiàn)象表明侵染菌絲可能先于AVRPiz-t轉(zhuǎn)移到臨近的未侵染的水稻細(xì)胞中［19］.在稻瘟菌激發(fā)子轉(zhuǎn)移過程中，effector：FPs融合蛋白會(huì)優(yōu)先在BIC 處積累，表明該結(jié)構(gòu)具有重要作用，并且，激發(fā)子轉(zhuǎn)移到BIC時(shí)需要啟動(dòng)子的參與［8］.相反，AVR1-CO39（圖1C）的轉(zhuǎn)移不需要啟動(dòng)子的參與，AVR1-CO39也不在BIC積累，而是分泌到位于真菌細(xì)胞壁和植物細(xì)胞膜的界面EIHM 處，隨后AVR1-CO39通過某種機(jī)制進(jìn)入植物細(xì)胞，該機(jī)制依賴于一種仍未知的轉(zhuǎn)移基序，這種轉(zhuǎn)移基序不同于之前描述的真菌序列如Tox A 中的RGD 基序或Avr L567中的疏水基序，這些基序在AVR1-CO39中沒有.也不同于RXLR-like基序，盡管它在AVR1-CO39中存在，它對(duì)無毒性不是必須的，即AVR1-CO39通過某種不依賴于病原菌系統(tǒng)的機(jī)制被獨(dú)立轉(zhuǎn)運(yùn)到水稻細(xì)胞中［16］.

此外，N 端的信號(hào)肽序列，盡管在功能上高度保守，但能引導(dǎo)不同的分泌目標(biāo)途徑，決定轉(zhuǎn)移的效率，甚至有后剪切功能［8］.研究表明AVR1-CO39的信號(hào)肽是有功能的且指導(dǎo)其分泌［16］.

圖1 激發(fā)子轉(zhuǎn)移示意圖Fig.1 Model for effector translocation by M.oryzae

4 稻瘟菌無毒激發(fā)子與水稻的互作

稻瘟菌無毒基因編碼的激發(fā)子與水稻抗病蛋白符合經(jīng)典的“基因?qū)颉奔僬f［31-32］，當(dāng)無毒基因發(fā)生變異后，具有對(duì)應(yīng)抗病基因的寄主不能識(shí)別該變異菌株，導(dǎo)致病害的發(fā)生［33］.AVR-Pita與Pita是稻瘟菌-水稻系統(tǒng)中第一個(gè)直接互作的例子［34］.Jia等［35］通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的分析，發(fā)現(xiàn)AVRPita176可以直接與Pita的LRR 結(jié)合，當(dāng)AVR-Pita176蛋白酶基序或Pita的LRD 單個(gè)氨基酸發(fā)生替換時(shí)會(huì)導(dǎo)致抗性的消失，并且這兩個(gè)區(qū)域的相互作用也隨之消失.而AVR-Pik與Pik的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)則表明Pik的LRR 與AVR-Pik不發(fā)生相互作用，Pik的CC 結(jié)構(gòu)域能與AVR-Pik發(fā)生相互作用，這在本氏煙草葉片中通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也得以證明［36］.這為稻瘟菌-水稻相互作用的研究提供了新的方向.

此外，由于絕大數(shù)R 蛋白通過輔助蛋白間接地與病原物Avr相互作用，因此又提出了間接相互作用模式；另有學(xué)者提出轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，該模式中有些AVR 蛋白通過激活R 基因啟動(dòng)子調(diào)控元件，進(jìn)而激活R 基因的大量表達(dá)，產(chǎn)生過敏性壞死［37］.

5 展望

激發(fā)子在植物-真菌系統(tǒng)中占有非常重要的作用.近年來，稻瘟菌激發(fā)子的研究已取得較大進(jìn)步.但是由于激發(fā)子從稻瘟菌轉(zhuǎn)移到水稻中的過程精細(xì)復(fù)雜，仍有許多問題亟待解決.如絕大多數(shù)稻瘟菌激發(fā)子在侵染過程中確切的作用和在水稻中起作用的方式是未知的；卵菌亞綱中細(xì)胞質(zhì)激發(fā)子N 端的RXLR 基序是激發(fā)子轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中所必須的，而稻瘟菌某些激發(fā)子也含有類似Lx AR 基序，但他們?cè)谵D(zhuǎn)移過程中的作用仍然不清楚［19］，甚至到目前為止，沒有一篇文獻(xiàn)報(bào)道稻瘟菌轉(zhuǎn)移過程中依賴哪種轉(zhuǎn)移基序（表1）.此外，稻瘟菌無毒蛋白與水稻抗性蛋白之間的互作模式仍不完善，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的證明.因此，全面深入了解稻瘟菌激發(fā)子分泌及轉(zhuǎn)移過程有利于研究水稻-稻瘟菌互作模式，從而形成更有針對(duì)性的水稻育種體系.

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