乳腺癌組織中沉默信息調(diào)節(jié)因子和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表達(dá)及臨床意義

高琳璐+于國(guó)華+張居民

[摘要] 目的 探討沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。 方法 收集濰坊市人民醫(yī)院2014年1～6月經(jīng)病理明確診斷的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌石蠟標(biāo)本60例和乳腺纖維瘤標(biāo)本15例，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中SIRT1和SPARC的表達(dá)情況。 結(jié)果 SIRT1在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（61.7%，37/60）明顯高于乳腺纖維腺瘤組織（33.3%，5/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；有乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SIRT1高表達(dá)率（72.0%，18/25）高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（25.7%，9/35），TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌中SIRT1高表達(dá)率（77.3%，17/22）高于Ⅰ、Ⅱ期（26.3%，10/38），差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。SPARC在乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá)率（73.3%，44/60）明顯高于腫瘤細(xì)胞（10.0%，6/60）和乳腺纖維腺瘤間質(zhì)細(xì)胞（40.0%，6/15），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；SPARC在乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高表達(dá)率（96.0%，24/25）高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的（74.3%，26/35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 乳腺癌中SIRT1、SPARC的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；乳腺腫瘤；SIRT1；SPARC

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（c）-0015-04

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)資料顯示，2000年全球新發(fā)女性乳腺癌病例超過(guò)100萬(wàn)，標(biāo)化發(fā)病率為35.66/10萬(wàn)，標(biāo)化病死率為12.5/10萬(wàn)，乳腺癌已成為全球婦女首發(fā)惡性腫瘤。在乳腺癌的病理類型中，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌惡性程度較高，預(yù)后較差。沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）基因位于10q22.1，長(zhǎng)約33 kb，蛋白分子量約為60 kU，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的脫乙?；富钚?，其廣泛存在于人體各個(gè)細(xì)胞內(nèi)。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC），是一種非膠原糖蛋白，它在腫瘤中的作用是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移，并改變腫瘤細(xì)胞基質(zhì)成分。兩者均與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究采用免疫組化檢測(cè)SIRT1和SPARC在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析SIRT1、SPARC與臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)本均為來(lái)源于濰坊市人民醫(yī)院2014年1～6月經(jīng)病理明確診斷的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌石蠟60例和乳腺纖維瘤15例，均為女性，年齡≥18歲，中位年齡43歲。所有乳腺癌患者均接受乳腺癌改良根治術(shù)或保乳術(shù)，術(shù)前均未行任何放療及化療治療，無(wú)嚴(yán)重、未控制的內(nèi)科疾病及感染，無(wú)病生存時(shí)間≥6個(gè)月。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)研究通過(guò)，本研究均在患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)的條件下進(jìn)行。依據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者分別為22、16、22例，且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，每例標(biāo)本均有免疫組化法檢測(cè)的雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達(dá)情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

SIRT1鼠抗人單克隆抗體（一抗，工作濃度1∶400）及SPARC兔抗人單克隆抗體（一抗，工作濃度1∶200）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒、抗體稀釋液、PBS沖洗液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化采用Envision法，組織標(biāo)本依次經(jīng)過(guò)常規(guī)切片，脫蠟入水，高壓修復(fù)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科專家對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，SIRT1在細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)為黃色或棕黃色，SPARC在細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色[1]。根據(jù)染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)進(jìn)行評(píng)分：不著色記為0分，著色淡者記為1分，著色中等記為2分，著色深者記為3分，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)：≤5%記為0分，>5%～25%記為1分，>25%～50%記為2分，>50%記為3分；兩者得分乘積為最后得分。0～1分記為陰性（-），2～3分記為弱陽(yáng)性（+），4～6分記為陽(yáng)性（++），>6分記為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。在統(tǒng)計(jì)分析中將表達(dá)（-）～（+）劃分為低表達(dá)，（++）～（+++）劃分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SIRT1和SPARC的表達(dá)及其與臨床病理因素的分析采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示（圖1，封三），SIRT1主要表達(dá)于乳腺癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。在乳腺纖維腺瘤及乳腺癌中，SIRT1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.3%（5/15）及61.7%（37/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 SPARC在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示（圖2，封三），SPARC表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。SPARC在乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá)率（73.3%，44/60）明顯高于乳腺癌腫瘤細(xì)胞（10.0%，6/60）和乳腺纖維腺瘤間質(zhì)細(xì)胞（40.0%，6/15），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。提示SPARC在乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)。

2.3 乳腺癌組織中SIRT1的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

乳腺癌中SIRT1的表達(dá)與患者年齡、腫物大小、ER、PR等因素均無(wú)關(guān)（P > 0.05），但與TNM分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織中SIRT1的表達(dá)與病理指標(biāo)的關(guān)系（例）

注： SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子；ER：雌激素受體；PR：孕激素受體

2.4 乳腺癌組織中SPARC的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

乳腺癌中SPARC的表達(dá)與患者年齡、腫物大小、ER、PR、TNM分期均無(wú)關(guān)（P > 0.05），但與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌組織中SPARC表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（例）

注：SPARC：富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白；ER：雌激素受體；PR：孕激素受體

3 討論

SIRTl是組蛋白脫乙酰酶（HDAC）第Ⅲ類蛋白質(zhì)家族的成員之一，并且是NAD+依賴性組蛋白和蛋白脫乙酰基酶。SIRT1不僅可以通過(guò)組蛋白脫乙酰誘導(dǎo)染色質(zhì)沉默，并且可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，在細(xì)胞的生理及病理過(guò)程中起重要作用，如基因沉默、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生等[13]。SIRT1表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。樊林等[14]研究認(rèn)為，胃癌組織中SIRT1的表達(dá)較正常組織表達(dá)增高，且浸潤(rùn)深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期越高時(shí)，表達(dá)隨之升高。另有學(xué)者研究證明，SIRT1的高表達(dá)率在子宮內(nèi)膜癌、肝癌、結(jié)直腸癌中明顯上升，且在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)[15]，在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16]，這可能與Wang等[17]發(fā)現(xiàn)的SIRT1是通過(guò)P13K/PTEN/AKT途徑促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。后期進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，STRT1還通過(guò)脫乙?；饔谜{(diào)控著諸多與腫瘤關(guān)系密切的信號(hào)因子，進(jìn)而影響著腫瘤的各種特性[18-20]。例如：Powell等[21]的研究表明SIRTl的缺失可誘導(dǎo)前列腺上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，表明了SIRT1的抗腫瘤作用。但關(guān)于SIRT1在乳腺癌組織中的表達(dá)研究較為少見(jiàn)。本研究顯示，在乳腺纖維腺瘤中SIRT1的陽(yáng)性表達(dá)率為33.3%，明顯低于乳腺癌中SIRT1的陽(yáng)性表達(dá)率（61.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌中SIRT1的高表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ、Ⅱ期（P < 0.05），這與宋新峰[22]研究結(jié)果一致。SIRT1的表達(dá)與患者年齡、性別、腫物大小、ER、RP表達(dá)情況無(wú)關(guān)（P > 0.05）。提示SIRT1可作為乳腺癌的診斷、病程判斷、預(yù)示乳腺癌的惡性程度的重要參考指標(biāo)。

SPARC是一種含有大量半胱氨酸（Cys）的酸性分泌蛋白，又稱骨連接蛋白（osteonec-fin）或基底膜40蛋白（BM40），編碼SPARC蛋白的基因位于人類染色體5q31.3～q32，包含10個(gè)外顯子，全長(zhǎng)25.9 kb，為單拷貝基因[2]。SPARC蛋白的主要功能是阻止細(xì)胞黏附、促使細(xì)胞變形、改變細(xì)胞周期、調(diào)整細(xì)胞分化及抑制某些生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的刺激，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，并能影響新生血管的生成[3]。SPARC具有明顯的組織特異性，已有研究表明，SPARC在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，在絕大多數(shù)異常痣中呈現(xiàn)中等表達(dá)[4-5]；在前列腺癌的部分原發(fā)灶中呈現(xiàn)低表達(dá)或中等表達(dá)，在大部分前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)[6]，此外，SPARC在惡性腫瘤中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。楊錫貴等[7]研究認(rèn)為在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者中，SPARC蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組升高；另有學(xué)者研究表明，在肺癌組織[8]及子宮內(nèi)膜癌組織[9]中，SPARC的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。學(xué)者將正常表達(dá)SPARC的小鼠和SPARC敲除小鼠進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移明顯慢于后者。這可能與SPARC表達(dá)減少后影響ECM聚集，導(dǎo)致膠原沉著和纖維形成減少，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移有關(guān)[10]。本研究結(jié)果表明，SPARC在乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中表達(dá)存在差異性，在乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá)率（73.3%）高于乳腺纖維腺瘤中高表達(dá)率（40.0%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在乳腺癌的間質(zhì)細(xì)胞中SPARC的高表達(dá)率明顯高于腫瘤細(xì)胞（10.0%）（P < 0.05），這與張雪梅[11]研究結(jié)果相一致。乳腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SPARC高表達(dá)率（96.0%）高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（74.3%）（P < 0.05），這與孫孝媛等[4]研究結(jié)果一致。說(shuō)明在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中SPARC的表達(dá)強(qiáng)度可能與乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這可能與Rotllant等[12]研究認(rèn)為的SPARC通過(guò)溶解細(xì)胞黏著斑、促使細(xì)胞變圓、促進(jìn)細(xì)胞骨架重排來(lái)完成其抗黏附作用，增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。SPARC在TNM分期為Ⅲ期的高表達(dá)率（94.4%）高于Ⅰ、Ⅱ期（76.3%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），考慮本研究納入乳腺癌患者例數(shù)較少，Ⅰ、Ⅱ期患者占63.3%。SPARC在乳腺癌組織中的表達(dá)是否與TNM分期有關(guān)，雖然本研究尚未得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，但可能隨著樣本量的增加，會(huì)出現(xiàn)有意義的結(jié)果。本研究結(jié)果表明，SPARC在乳腺癌中的表達(dá)與患者年齡、ER、PR、腫物大小、病理分期等因素?zé)o關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些提示SPARC與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，SIRT1、SPARC在乳腺癌組織中均呈高表達(dá)。SIRT1和SPARC均參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，兩者之間的具體作用機(jī)制及兩者之間是否存在相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-10-14 本文編輯：蘇 暢）