水提醇沉法提取半枝蓮粗多糖中總糖含量的最佳工藝研究

紀(jì)耀華，趙 帥

(1長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，長春 130031;2 長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長春 130117)

半枝蓮(Scutellaria barbata)為唇形科植物半枝蓮的干燥全草［1］，被人們所認(rèn)可的主要有效成分為黃酮類、多糖和揮發(fā)性物質(zhì)［2］，其中，黃酮類化合物是從半枝蓮中得到最多的一類成分，被認(rèn)為是其主要的生理活性物質(zhì)。在半枝蓮的揮發(fā)性成分的研究方面，張福維等［3］曾采用蒸餾-萃取法從半枝蓮中提取并鑒定出35 種揮發(fā)性成分化合物，包含了酮類、醛類、醇類、酚類、酸類、烯烴類、烷烴類等多種類化合物，占揮發(fā)油總量的87.45%，而同為半枝蓮主要提取成分之一的半枝蓮粗多糖由于其良好的抗腫瘤活性作用而在近些年備受關(guān)注。文獻(xiàn)表明，機(jī)體為維持正常免疫功能調(diào)節(jié)作用需Th1 和Th2 亞群細(xì)胞因子相互抑制、相互轉(zhuǎn)化，保持平衡，一旦兩者失衡將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。葉華［4］等通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌等多種腫瘤患者體內(nèi)Th2 型細(xì)胞因子占優(yōu)勢，且Th1/Th2 的偏移與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，并通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，半枝蓮粗多糖能降低C26 結(jié)腸癌小鼠瘤重，有效糾正腫瘤所引起的Th1/Th2 失衡，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤功能，改善免疫狀態(tài)，進(jìn)而起到治療腫瘤的作用。李潔等［5］采用MTT 比色法檢測不同濃度半枝蓮含藥血清對K562/A02 耐藥株的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，從而證明了半枝蓮在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對化療藥物的敏感性。宋高臣［6］等研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮粗多糖能提高化療藥物的抑瘤率，提高單核吞噬細(xì)胞功能和IL-2、TNF-α 活性，并提出半枝蓮粗多糖可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能實(shí)現(xiàn)對化療藥物的增效減毒作用。陳愛東［7］等利用人胃癌細(xì)胞裸鼠種植瘤模型，并通過ELISA 法檢測模型外周血血清中P21 和VEGF 含量從而觀察半枝蓮粗多糖對胃癌小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)半枝蓮粗多糖在小鼠體內(nèi)具有抑制胃癌小鼠模型癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散的作用。于水瀾［8］等通過研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮粗多糖對肝癌的治療是通過改變蛋白質(zhì)表達(dá)，從而調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)共同作用所致。張晶［9］等依據(jù)許多疾病與生物膜脂流動(dòng)性有關(guān)，對S180 荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜進(jìn)行多項(xiàng)檢測并發(fā)現(xiàn)半枝蓮粗多糖可改善其紅細(xì)胞膜功能狀態(tài)，提高膜的流動(dòng)性，增強(qiáng)紅細(xì)胞的免疫功能。近年實(shí)驗(yàn)研究者們還發(fā)現(xiàn)，半枝蓮粗多糖具有清除自由基、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、影響蛋白質(zhì)表達(dá)，對S180 肉瘤抑制作用等［10-12］。

本文通過傳統(tǒng)水提醇沉方法下對半枝蓮粗多糖中總糖含量最適高效提取方案進(jìn)行探索，為半枝蓮粗多糖適用于大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 設(shè)備與耗材

1.1 試驗(yàn)設(shè)備

U-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普西通用儀器責(zé)任有限公司)、電子天平CPA224S (賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑

半枝蓮(吉林省吉深醫(yī)藥實(shí)業(yè)有限公司)、分析純級(jí)的苯酚、濃硫酸、乙醇;標(biāo)準(zhǔn)品:無水葡萄糖(飛宇生物科技有限公司，含量大于98%，批號(hào):FY18720206)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 半枝蓮樣品液的制備

半枝蓮樣品液的制備工藝流程如下:

2.2 提取條件因素水平設(shè)定

對提取時(shí)間、溫度、料液比三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)定如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3 半枝蓮粗多糖中總糖含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖0.0148g，用水溶解成濃度為148.1μg/mL 的溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 依次精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于試管中，然后用蒸餾水分別稀釋到2.0mL 后再精密加入6%苯酚1.0mL 與濃硫酸5mL，振搖混勻后放置5min，沸水浴加熱15min 后立即冷水浴至室溫。在490nm 波長處用蒸餾水作為空白對照測定吸收度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A (吸收度)=1.1492C (濃度)－0.0004，r=0.9983。

2.3.3 樣品溶液中半枝蓮粗多糖中總糖含量的測定取1mL 半枝蓮樣品溶液，經(jīng)過與2.2.2 相同操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測取多糖含量。

3 試驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)優(yōu)化

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)表1 進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析數(shù)據(jù)如表2 和表3 所示。

表2 正交試驗(yàn)

表3 方差分析

3.2 結(jié)論

(1)各因素對指標(biāo)的影響由極差R 反映，由RA＞RC＞RB知，影響半枝蓮粗多糖得率從主到次的因素排序?yàn)锳 (時(shí)間)、C (料液比)、B (溫度)。

(3)在水平α=0.05 下，F(xiàn)0.05(2，2)=19，由于FA、FB、FC均大于F0.05(2，2=19)，故A、B、C 三因素對半枝蓮粗多糖中總糖的提取率影響均顯著。

3.3 討論

通過以上正交試驗(yàn)結(jié)果得出，通過傳統(tǒng)方法以水提取有效成分，以醇除雜精制的方法提取半枝蓮粗多糖中總多糖含量最適高效提取方案為料液比1∶3，100℃下浸提1h。

由于中藥特有的復(fù)雜性，對于半枝蓮的最佳提取工藝［13］仍在摸索之中，尚不具有統(tǒng)一意見。影響半枝蓮粗多糖含量的因素有很多，從植物生長環(huán)境因素方面來看，不同產(chǎn)地、不同的栽培方式造成的植物的生長環(huán)境、溫度、濕度等差異都可能引起半枝蓮粗多糖含量的高低不等。鑒于半枝蓮的產(chǎn)地繁多，李潔［14］對產(chǎn)自云南墨江、江蘇南通等地的半枝蓮進(jìn)行了含量測定，測量結(jié)果表明，上述產(chǎn)地中半枝蓮粗多糖含量最高的為云南墨江為8.12%，而浙江慶元僅含半枝蓮粗多糖2.34%，兩者相差約3 倍，可見不同產(chǎn)地對半枝蓮粗多糖的含量影響較大。從藥材加工工藝、藥材提取工藝等方面來講，我們所使用的最為傳統(tǒng)的化學(xué)成分提取方法是溶劑提取法，其提取時(shí)間、溫度、次數(shù)和料液比均可對其多糖含量造成影響，而隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)，如微波技術(shù)、超臨界二氧化碳萃取法、大孔吸附樹脂技術(shù)也相繼用于半枝蓮化學(xué)成分的提取［15］，力求將藥物成分得到最高的利用價(jià)值。

本文希望通過對半枝蓮粗多糖的提取條件加以試驗(yàn)分析，探索最佳提取工藝，為開發(fā)和提高半枝蓮資源的利用，以及半枝蓮大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供更有利的參考價(jià)值，為今后的深入研究做好前期鋪墊。

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