• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    缺氧增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的初步研究

    2015-03-08 05:17:20李鵬程徐倫山肖華亮第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科重慶40004第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科重慶40004
    局解手術(shù)學(xué)雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:缺氧干性膠質(zhì)瘤

    李鵬程,周 椿,徐倫山,肖華亮 (.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科,重慶40004;.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科,重慶 40004)

    缺氧增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的初步研究

    李鵬程1,周椿1,徐倫山1,肖華亮2(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科,重慶400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科,重慶 400042)

    [摘要]目的研究在體外環(huán)境下,缺氧與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)“干性”的關(guān)系。方法選擇U87細(xì)胞和U251細(xì)胞以及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞并進(jìn)行缺氧處理。用透射電子顯微鏡法來檢測(cè)這些細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);用MTT法來檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng);用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)細(xì)胞周期以及CD133的表達(dá);用transwell法來檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;用集落形成分析來分析細(xì)胞的集落形成能力;并用實(shí)時(shí)定量PCR來檢測(cè)干細(xì)胞以及其分化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。結(jié)果缺氧使原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞維持在一個(gè)未分化的狀態(tài),減慢處于相對(duì)靜止階段的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增加它們的集落形成能力和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,而且能提高干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。腫瘤干細(xì)胞的分化標(biāo)志物在進(jìn)行缺氧處理后降低。結(jié)論缺氧能夠使已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞“去分化”而使其獲得“干性”。

    [關(guān)鍵詞]腫瘤干細(xì)胞;干性;缺氧;膠質(zhì)瘤

    膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要腫瘤,占成人顱內(nèi)腫瘤的35%~50%。而且,在膠質(zhì)瘤中有60%是惡性膠質(zhì)瘤[1]。目前,手術(shù)治療同時(shí)聯(lián)合放療、化療以及生物治療仍然是膠質(zhì)瘤的主要治療手段。然而,這些方法的治療效果并不理想。標(biāo)準(zhǔn)的治療方法同時(shí)聯(lián)合放療和/或化療能使患者的平均生存時(shí)間僅為14.6個(gè)月[2]。近些年來,越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)參與了癌癥的發(fā)展過程,且能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),引起腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移[3]。由于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用,CSCs可能成為治療癌癥的一個(gè)靶點(diǎn)。然而,需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確腫瘤細(xì)胞尤其是CSCs的生長(zhǎng)和分化與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。

    缺氧是包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的幾乎所有惡性腫瘤的重要特征。缺氧對(duì)于腫瘤血管生成和能量代謝的影響已較為明確,而缺氧對(duì)于腫瘤細(xì)胞尤其是CSCs的生長(zhǎng)和分化的影響有待進(jìn)一步探索[4]。在這些研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)的目的是研究CSCs和腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系,以便更好地理解CSCs分化的機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中,我們研究了缺氧和CSCs分化的相關(guān)因素,以期為膠質(zhì)瘤的治療提供很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1CSCs的分離、鑒別和培養(yǎng)

    根據(jù)文獻(xiàn)中的免疫磁珠細(xì)胞分離方法(MACS)分離CSCs和CD133陽性的腫瘤細(xì)胞[5]。首先,取新鮮的腫瘤組織并進(jìn)行沖洗,同時(shí)去除壞死的組織和血液。然后,將腫瘤組織切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊,再用胰酶進(jìn)行消化并離心。收集離心出來的細(xì)胞,并在含有bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)液里進(jìn)行培養(yǎng)。收集原代神經(jīng)球,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133陽性和CD133陰性的腫瘤細(xì)胞,再進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)。

    1.2細(xì)胞周期檢測(cè)

    將U87細(xì)胞在常氧或者1%O2的環(huán)境中培養(yǎng)。然后在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

    1.3免疫磁珠方法分離細(xì)胞

    磁場(chǎng)能將細(xì)胞上結(jié)合的標(biāo)志物和細(xì)胞分開。在我們過去的研究中,用這個(gè)方法成功地分離了CD133陽性細(xì)胞和膠質(zhì)瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞[5-6]。CD133微球和羊抗鼠IgG微球購(gòu)自德國(guó)的Miltenyi公司。

    1.4MTT分析

    用MTT來檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),并描繪生長(zhǎng)曲線。收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,并制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整到5 000/孔(用無菌的PBS溶液加滿邊緣孔)。將細(xì)胞放在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直到細(xì)胞鋪滿孔底(平底96孔板),然后將細(xì)胞放在常氧或者缺氧環(huán)境中培養(yǎng)。將20 μl的MTT溶液加入到每一個(gè)孔里(5 mg/mL的0.5%MTT溶液),然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,將上清液棄去,再在每個(gè)孔里加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO),然后將培養(yǎng)板放在搖床上低速震蕩10 min來完全溶解結(jié)晶。最后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度值。

    1.5集落形成分析

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞,并用0.5%胰酶/0.04% EDTA消化,來制備單細(xì)胞懸液。然后,將這些細(xì)胞加入到24孔板中(50個(gè)細(xì)胞/孔),再將其在37 ℃、飽和濕度和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。未貼壁的細(xì)胞被棄去。培養(yǎng)2~3周后,出現(xiàn)了大的集落,然后用0.5%胰酶/0.04% EDTA來消化集落制備單細(xì)胞懸液。然后將這些細(xì)胞接種在96孔板中,再繼續(xù)在37 ℃、飽和濕度和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng),觀察其集落形成能力以及集落的形態(tài),并測(cè)量集落的大小以及計(jì)數(shù)每個(gè)集落中的細(xì)胞數(shù)。這次,將細(xì)胞分成早期傳代組以及晚期傳代組。在早期傳代組中,用0.5%胰酶/0.04%EDTA消化制備單細(xì)胞懸液,然后將這些細(xì)胞接種到96孔板中。在晚期傳代組中,用0.5%胰酶/0.04%EDTA消化制備單細(xì)胞懸液,然后將細(xì)胞接種到96孔板中。

    1.6Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

    將40 μl人工基底膜(matrigel膠+無血清培養(yǎng)基)加入到上室,在37 ℃環(huán)境中過夜。然后將細(xì)胞(1×106/mL)加入到上室中(100 μl),再將條件培養(yǎng)基(600 μl)加到下室中并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后將Transwell小室取出,將上室中的培養(yǎng)液棄去。再用PBS溶液清洗上室。用棉簽擦去Matrigel膠和上室內(nèi)的殘余細(xì)胞。接下來,用PBS溶液清洗上室,并浸入4%多聚甲醛中30 min來固定上室內(nèi)的細(xì)胞。用PBS溶液清洗2次后,用結(jié)晶紫對(duì)上室進(jìn)行染色20 min。用ddH2O清洗上室3次以上并晾干后,置于光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)孔選擇3個(gè)視野來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    1.7統(tǒng)計(jì)分析

    2結(jié)果

    2.1缺氧對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響

    用MTT來檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。圖1顯示了U87和x02GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示缺氧能夠輕度抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),但是并不顯著。圖2顯示了細(xì)胞周期結(jié)果,表明在1% O2中缺氧處理2、12、24 h對(duì)細(xì)胞周期并沒有顯著影響。然而,缺氧處理48 h后,在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量較常氧組顯著增加(P<0.05),而且在G2/M期的細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.01)。細(xì)胞周期的變化與上述變化相似。

    a:U87細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;b:x02GBM細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

    缺氧(1%O2)處理2、12、24和48 h后,G0/G1期,G2/M期和S期的U87細(xì)胞 (*:P<0.05;#:P<0.01;n=3)

    圖2缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

    2.2缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的集落形成能力的影響

    集落形成分析顯示缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤的集落形成能力有顯著的影響(圖3)。缺氧處理后,U251細(xì)胞的集落形成能力顯著高于常氧組(P<0.05)。尤其是致密型的集落比例顯著增加。在缺氧的條件下,U251細(xì)胞的致密型集落的比例顯著高于常氧組(P<0.01)。

    a:缺氧對(duì)U251細(xì)胞的集落形成能力的影響;b:在常氧和缺氧條件下,不同類型U251細(xì)胞集落之間比較(*:P<0.05;#:P<0.01)

    圖3缺氧對(duì)U251細(xì)胞的集落形成能力的影響

    2.3缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

    用Transwell法來分析細(xì)胞的遷移能力。缺氧處理2 h后,U87細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)與常氧組相近。缺氧處理12 h和24 h后,穿膜的細(xì)胞數(shù)與常氧組相比顯著增加(P<0.05),見圖4。

    圖4 缺氧(1%O2)對(duì)細(xì)胞遷移的影響(*:P<0.05)

    2.4缺氧對(duì)于CSCs標(biāo)志物及其分化標(biāo)志物的影響

    2.4.1缺氧對(duì)CD133表達(dá)的影響經(jīng)過1%O2處理48 h后,檢測(cè)CD133的表達(dá)水平。跟常氧組相比,缺氧顯著增加了CD133的表達(dá)以及CD133陽性細(xì)胞數(shù)量(圖5c)。常氧組中CD133陽性的x01GBM細(xì)胞的比例是(4.38±0.95)%(n=3),經(jīng)過缺氧處理48 h后CD133陽性的x01GBM細(xì)胞的比例是(15.90±1.38)%(n=3),兩者之間存在顯著差異(P<0.01),見圖5a~c。

    2.4.2缺氧對(duì)CSCs標(biāo)志物及其mRNA表達(dá)的影響實(shí)時(shí)定量PCR被用來檢測(cè)CSCs標(biāo)志物(OCT-4,SOX-2)和CSCs的分化標(biāo)志物(GFAP)。OCT-4的擴(kuò)增曲線很光滑,具有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期,表現(xiàn)出特異性的增長(zhǎng)。圖6顯示了不同時(shí)間點(diǎn)U87中的OCT-4、SOX-2和GFAP的mRNA表達(dá)。在常氧組中,U87細(xì)胞中沒有OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)。經(jīng)過缺氧(1%O2)處理2、12和24 h后,OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)增加了;經(jīng)過缺氧(1%O2)處理48 h和72 h后,OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)跟其他組相比最高(P<0.01)。然而,GFAP的mRNA變化與上述變化相反。經(jīng)過缺氧(1%O2)處理2 h和12 h后,GFAP的mRNA反而下降了,而且在處理48 h后仍維持在一個(gè)低水平。經(jīng)過缺氧處理48 h和72 h后,U87細(xì)胞中GFAP的mRNA水平顯著低于常氧組以及缺氧處理2 h組(P<0.01)。如果經(jīng)過0.5 μg/mL DAPT(一種Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性抑制劑)預(yù)處理,在缺氧治療72 h后,U87細(xì)胞中OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)水平顯著低于單用缺氧治療的U87細(xì)胞中的mRNA水平(P<0.01)。然而GFAP的mRNA變化水平表現(xiàn)出相反的規(guī)律(P<0.01)。

    空白峰區(qū)為同型對(duì)照,紅色峰區(qū)為CD133表達(dá);a:常氧條件下,x01GBM細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平;b:缺氧處理48 h后,x01GBM細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平;c:缺氧(1%O2)處理后,CD133陽性細(xì)胞的比例跟常氧組相比明顯增加(*:P<0.05;#:P<0.01)

    圖5缺氧對(duì)CD133表達(dá)的影響

    a:在U87細(xì)胞中OCT-4的mRNA表達(dá);b:在U87細(xì)胞中SOX-2的mRNA表達(dá);c:在U87細(xì)胞中GFAP的mRNA表達(dá);*與缺氧48 h和72 h比較,P<0.05;#:與缺氧72 h比較,P<0.01

    圖6缺氧對(duì)OCT-4、SOX-2以及GFAP的mRNA的表達(dá)的影響

    3討論

    缺氧是一種普遍的生理和病理生理現(xiàn)象。發(fā)生缺氧時(shí),人的身體會(huì)通過復(fù)雜的機(jī)制來適應(yīng)缺氧。例如,在缺氧的情況下,機(jī)體會(huì)增加糖酵解來代償氧化磷酸化減少而引起的能量不足[7];在缺氧的情況下,機(jī)體會(huì)增加血管生成來提高血管密度,從而改善血供;系統(tǒng)性缺氧可造成生理性的紅細(xì)胞生成素增加,從而適應(yīng)缺氧環(huán)境。此外,缺氧同樣是一種普遍的病理現(xiàn)象。例如,缺氧在癌癥中是一種常見的現(xiàn)象[8]。

    過去有實(shí)驗(yàn)已證明缺氧能誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá),從而調(diào)節(jié)能影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的不同目標(biāo)基因以及腫瘤的血管生成[9-11]。近年來,很多研究表明缺氧與干細(xì)胞的未分化狀態(tài)有關(guān),并與神經(jīng)脊和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[12-13]。一些干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)分子參與了缺氧對(duì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)。迄今為止,研究發(fā)現(xiàn)參與干細(xì)胞的正常自我更新和分化的分子包括Wnt、BMP、Notch和Sonic hedgehog (Shh)。近期的研究顯示缺氧可能激活HIF-1α從而上調(diào)Notch信號(hào)通路中的對(duì)于維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)至關(guān)重要的下游分子[14]。Covello等[15]證實(shí)了干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT-4是HIF-2α的一個(gè)目標(biāo)因子。HIF-2α能夠激活OCT-4從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化。Kaidi等[16]的研究同樣顯示W(wǎng)nt/β-catenin能夠與HIF-1α相互作用。因此,已有確切的證據(jù)顯示缺氧與調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞的干性的信號(hào)通路相關(guān)。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路中的分子參與了CSCs的自我更新和分化[17-18]。Axelson等[19]發(fā)現(xiàn)缺氧能夠改變神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中分化相關(guān)基因的表達(dá),能夠促進(jìn)已分化細(xì)胞的去分化以及使這些細(xì)胞獲得干細(xì)胞特征。Tavaluc等[20]證明了缺氧能夠增加側(cè)群腫瘤細(xì)胞。然而,關(guān)于缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤中CSCs細(xì)胞的影響的研究還是很少。

    在我們的前期研究中,發(fā)現(xiàn)CA IX表達(dá)與干細(xì)胞的侵襲性和腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。基于這些研究結(jié)果,我們假設(shè)缺氧能夠增加膠質(zhì)瘤中CSCs的干性,并進(jìn)一步較全面地證明了此假設(shè)。首先,檢測(cè)缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明缺氧能維持未分化狀態(tài),而常氧能促進(jìn)細(xì)胞分化。我們還描繪了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)了細(xì)胞周期。結(jié)果顯示,缺氧能減慢生長(zhǎng)速度而且增加靜止期的細(xì)胞比例。然后,我們檢測(cè)了缺氧處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。我們研究了缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示缺氧能夠促進(jìn)這些細(xì)胞的自我更新和遷移能力。最后,用PCR來研究缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤中CSCs及其分化標(biāo)志物的影響。結(jié)果顯示缺氧能增加CSCs標(biāo)志物CD133和巢蛋白的表達(dá),但是減少了分化標(biāo)志物GFAP陽性的細(xì)胞比例?;谌毖鯇?duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能、CSCs自我更新和遷移能力和干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響,我們總結(jié)出缺氧能夠使分化的細(xì)胞去分化而且促進(jìn)這些細(xì)胞獲得干細(xì)胞能力。然而,干性的增加是由于膠質(zhì)瘤中已分化的細(xì)胞去分化導(dǎo)致的CSCs增加,還是由于缺氧導(dǎo)致的CSCs增殖增加仍不清楚,還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果。

    總而言之,我們的研究全面證明了在體外環(huán)境下缺氧能夠增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性,但是仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這個(gè)結(jié)果,而且這種影響的具體機(jī)制仍不清楚。在我們未來的研究中,我們將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并研究這些影響的機(jī)制,從而篩選出膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)。目前,關(guān)于CSCs的研究仍處于初級(jí)階段,還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明CSCs與其微環(huán)境之間的關(guān)系。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Ouyang H,Guo Z,Cheng Z,et al.siRNA-mediated knockdown of JUB expression suppresses the proliferation of glioblastoma cells[J].Cancer Biomark,2015,15(4):477-84.

    [2] Thirant C,Galan-Moya EM,Dubois LG,et al.Differential proteomic analysis of human glioblastoma and neural stem cells reveals HDGF as a novel angiogenic secreted factor[J].Stem Cell,2012,30(5):845-853.

    [3] Rossi DJ,Jamieson CH,Weissman IL.Stems cells and the pathways to aging and cancer[J].Cell,2008,132(4):681-696.

    [4] Keith B,Simon MC.Hypoxia-inducible factors,stem cells,and cancer[J].Cell,2007,29(3):465-472.

    [5] Yi L,Zhou ZH,Ping YF,et al.Isolation and characterization of stem cell-like precursor cells from primary human anaplastic oligoastrocyt-oma[J].Modern Pathol,2007,20(10):1061-1068.

    [6] Seo SK,Jeong HY,Park SG,et al.Blockade of endogenous B7-H1 suppresses antibacterial protection after primary Listeria monocytogenes infection[J].Immunology,2008,123(1):90-99.

    [7] Bruick RK.Oxygen sensing in the hypoxic response pathway:regulation of the hypoxia-inducible transcription factor[J].Genes Dev,2003,17(21):2614-2623.

    [8] Semenza GL.Hypoxia-inducible factor 1:oxygen homeostasis and disease pathophysiology[J].Trends Mol Med,2001,7(8):345-350.

    [9] Raval RR,Lau KW,Tran MG,et al.Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1(HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma[J].Mol Cell Biol,2005,25(13):5675-5686.

    [10] Ryan HE,Lo J,Johnson RS.HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization[J].EMBO J,1998,17(11):3005-3015.

    [11] Carroll VA,Ashcroft M.Role of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha versus HIF-2alpha in the regulation of HIF target genes in response to hypoxia,insulin-like growth factor-I,or loss of von Hippel-Lindau function:implications for targeting the HIF pathway[J].Cancer Res,2006,66(12):6264-6270.

    [12] Morrison SJ,Csete M,Groves AK,et al.Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells[J].J Neurosci,2000,20(19):7370-7376.

    [13] Studer L,Csete M,Lee SH,et al.Enhanced proliferation,survival,and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen[J].J Neurosci,2000,20(19):7377-7383.

    [14] Gustafsson MV,Zheng X,Pereira T,et al.Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state[J].Dev Cell,2005,9(5):617-628.

    [15] Covello KL,Kehler J,Yu H,et al.HIF-2alpha regulates Oct-4:effects of hypoxia on stem cell function,embryonic development,and tumor growth[J].Genes Dev,2006,20(5):557-570.

    [16] Kaidi A,Williams AC,Paraskeva C.Interaction between beta-catenin and HIF-1 promotes cellular adaptation to hypoxia[J].Nat Cell Biol,2007,9(2):210-217.

    [17] Rossi DJ,Jamieson CHM,Weissman IL.Stems cells and the pathways to aging and cancer[J].Cell,2008,132(4):681-696.

    [18] Keith B,Simon MC.Hypoxia-inducible factors,stem cells,and cancer[J].Cell,2007,129(3):465-472.

    [19] Axelson H,Fredlund E,Ovenberger M,et al.Hypoxia-induced dedifferentiation of tumor cells-A mechanism behind heterogeneity and aggressiveness of solid tumors[J].Semin Cell Dev Biol,2005,16(4-5):554-563.

    [20] Tavaluc RT,Hart LS,Dicker DT,et al.Effects of low confluency,serum starvation and hypoxia on the side population of cancer cell lines[J].Cell Cycle,2007,6(20):2554-2562.

    (編輯:周小林)

    Hypoxia enhances stemness of cancer stem cells in glioblastoma

    LI Peng-cheng1,ZHOU Chun1,XU Lun-shan1,XIAO Hua-liang2(1.Department of Neurosurgery,Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military University,Chongqing 400042,China;2.Department of Pathology,Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military University,Chongqing 400042,China)

    Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between hypoxia and stemness of cancer stem cells (CSCs).MethodsU87 cells,U251 cells and primary glioma cells were experienced hypoxia.Detected the ultrastructure of these cancer cells with transmission electron microscopy; detect the cell growth with MTT assay; cell cycle and CD133 expression were detected by flow cytometry; and the cell migration ablity were detected through transwell chamber assay; the colony-forming efficiency were deteced by colony-forming assay; and real-time quantitative PCR and Western blot were carried out to detect the mRNA and protein expression of markers of stem cells and their differentiation respectively.ResultsHypoxia maintained the undifferentiated state of primary glioma cells, slowed down the growth of glioma cells which were in a relatively quiescent stage, increased the colony forming efficiency and migration of glioma cells, and increased the expression of markers of stem cells, but the expression of markers for stem cell differentiation was reduced after hypoxia treatment.ConclusionHypoxia may induce the “dedifferentiation” of differentiated glioma cells which then acquire the stemness.

    Keywords:cancer stem cells;stemness;hypoxia;glioblastoma

    [收稿日期]2015-04-28[修回日期] 2015-06-15

    [通訊作者]徐倫山,E-mail:xuliu559@163.com;肖華亮,E-mail:xiaoyyuk@163.com

    [基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(30872649)

    doi:10.11659/jjssx.01E015027

    [中圖分類號(hào)]R730.5

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1672-5042(2015)05-0479-05

    猜你喜歡
    缺氧干性膠質(zhì)瘤
    薯蕷皂苷元調(diào)控Nrf2信號(hào)通道干預(yù)大鼠干性AMD氧化應(yīng)激機(jī)制的研究
    夏季頻發(fā)溺水事件,“干性溺水”是怎么回事
    方圓(2017年12期)2017-07-17 17:48:12
    貧困山區(qū)教育“缺氧”現(xiàn)象原因淺析
    原花青素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用
    乳酸清除率對(duì)感染性休克患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值
    DCE-MRI在高、低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤及腦膜瘤中的鑒別診斷
    磁共振成像(2015年8期)2015-12-23 08:53:14
    P21和survivin蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義
    夏季游泳要提防“干性溺水”
    鈣蛋白酶在COPD患者慢性缺氧性骨骼肌萎縮中的作用
    Sox2和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義
    国产精品国产高清国产av| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美三级亚洲精品| 国产伦在线观看视频一区| 中文在线观看免费www的网站| 麻豆成人午夜福利视频| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品,欧美在线| 深夜a级毛片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产午夜精品论理片| 观看免费一级毛片| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲精品一区av在线观看| 永久网站在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久电影中文字幕| 国产美女午夜福利| 免费搜索国产男女视频| 一级毛片久久久久久久久女| 成年女人永久免费观看视频| 在线免费观看的www视频| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲人与动物交配视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 床上黄色一级片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在线观看一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲三级黄色毛片| 免费看av在线观看网站| 51国产日韩欧美| 免费观看的影片在线观看| 欧美在线一区亚洲| 观看美女的网站| 变态另类丝袜制服| 亚洲精品成人久久久久久| 免费在线观看影片大全网站| 黄色日韩在线| 内射极品少妇av片p| 国产亚洲精品av在线| 中文字幕久久专区| 天堂影院成人在线观看| 中出人妻视频一区二区| 99热6这里只有精品| 日本欧美国产在线视频| 俺也久久电影网| а√天堂www在线а√下载| 丰满乱子伦码专区| 五月玫瑰六月丁香| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 22中文网久久字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 看片在线看免费视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 最近在线观看免费完整版| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩精品有码人妻一区| 熟女电影av网| 日韩欧美在线乱码| 国产精品久久久久久久久免| 精品欧美国产一区二区三| 久久6这里有精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 老司机午夜福利在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 丝袜美腿在线中文| 两个人视频免费观看高清| 极品教师在线免费播放| 乱人视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 少妇丰满av| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 99视频精品全部免费 在线| 一级黄色大片毛片| 日韩精品中文字幕看吧| 久久精品国产亚洲av涩爱 | av国产免费在线观看| 美女大奶头视频| 国产精品无大码| 午夜福利18| 国产 一区精品| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品一区av在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 村上凉子中文字幕在线| 国产三级在线视频| 亚洲精品一区av在线观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲精品一区av在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲美女黄片视频| 美女免费视频网站| 色在线成人网| 村上凉子中文字幕在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜a级毛片| 欧美bdsm另类| 草草在线视频免费看| 美女黄网站色视频| 亚洲av美国av| 国产一区二区在线av高清观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久精品综合一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 岛国在线免费视频观看| 最后的刺客免费高清国语| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久九九精品影院| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 91精品国产九色| 日本 欧美在线| 日本免费a在线| 日韩欧美免费精品| 久久久久久国产a免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | av专区在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 在线播放无遮挡| 成人永久免费在线观看视频| 看黄色毛片网站| 91在线观看av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 村上凉子中文字幕在线| 伦精品一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 能在线免费观看的黄片| 亚洲人与动物交配视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 无人区码免费观看不卡| 美女 人体艺术 gogo| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 啦啦啦啦在线视频资源| 一级av片app| 黄色丝袜av网址大全| 免费观看精品视频网站| 色5月婷婷丁香| 国产黄片美女视频| 一区二区三区激情视频| 国产三级在线视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲av二区三区四区| 三级国产精品欧美在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 国产 一区精品| 久久久久久伊人网av| 国产精品,欧美在线| 天堂√8在线中文| 一个人免费在线观看电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久亚洲真实| 欧美色视频一区免费| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产三级在线视频| 99热网站在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一级毛片久久久久久久久女| videossex国产| 可以在线观看的亚洲视频| 色av中文字幕| 欧美日本视频| 九九在线视频观看精品| 在线观看av片永久免费下载| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲综合色惰| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久国内视频| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线播放国产精品三级| 欧美潮喷喷水| 国内精品一区二区在线观看| 不卡一级毛片| 久久精品国产自在天天线| 麻豆国产97在线/欧美| a级毛片a级免费在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 桃红色精品国产亚洲av| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久久噜噜| 搞女人的毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产三级在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 搡老岳熟女国产| 免费黄网站久久成人精品| 在现免费观看毛片| 高清毛片免费观看视频网站| 国产美女午夜福利| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲性久久影院| 国语自产精品视频在线第100页| 女同久久另类99精品国产91| 一级黄色大片毛片| 国产精品一区二区性色av| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲美女视频黄频| 欧美一区二区国产精品久久精品| videossex国产| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 一本精品99久久精品77| 91在线观看av| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩欧美免费精品| 久久九九热精品免费| 色视频www国产| 国内精品久久久久精免费| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本黄色视频三级网站网址| 搡老岳熟女国产| 免费高清视频大片| 精品免费久久久久久久清纯| 精品一区二区三区视频在线| 国产69精品久久久久777片| 国产成人a区在线观看| 欧美日本视频| 国产一区二区三区视频了| 热99在线观看视频| 观看美女的网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99热这里只有精品一区| 亚洲中文日韩欧美视频| av福利片在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 99国产精品一区二区蜜桃av| 桃色一区二区三区在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 中文亚洲av片在线观看爽| 五月伊人婷婷丁香| 长腿黑丝高跟| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产成人一区二区在线| 午夜福利18| 亚洲无线在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91麻豆av在线| 赤兔流量卡办理| 欧美激情国产日韩精品一区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲在线观看片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产高清视频在线播放一区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一区二区三区激情视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 极品教师在线免费播放| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久成人av| 久久人妻av系列| 国产精品99久久久久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成人永久免费在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 97碰自拍视频| 久久久久久久久久黄片| 久久久久国内视频| 级片在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 在线免费观看的www视频| 天天躁日日操中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲综合色惰| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美丝袜亚洲另类 | 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜亚洲福利在线播放| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜视频国产福利| 日韩欧美 国产精品| 亚洲内射少妇av| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 又紧又爽又黄一区二区| 久久99热这里只有精品18| 一夜夜www| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲午夜理论影院| 午夜福利高清视频| 欧美精品国产亚洲| 一本一本综合久久| 99热这里只有是精品50| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美区成人在线视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 又紧又爽又黄一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 搡老妇女老女人老熟妇| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品日韩av片在线观看| 免费大片18禁| 免费看av在线观看网站| 91狼人影院| eeuss影院久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲第一电影网av| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久久久大av| 亚洲国产精品成人综合色| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 老女人水多毛片| 日本成人三级电影网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产成人影院久久av| 99久久成人亚洲精品观看| 在线观看66精品国产| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久亚洲真实| 亚洲在线自拍视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜激情福利司机影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜a级毛片| 一本一本综合久久| 日韩欧美在线乱码| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产伦人伦偷精品视频| 91精品国产九色| 在线观看免费视频日本深夜| 国产高清视频在线观看网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 91狼人影院| 成人三级黄色视频| 国产精品久久视频播放| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 成年女人永久免费观看视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲专区国产一区二区| 88av欧美| 无人区码免费观看不卡| 内射极品少妇av片p| 午夜影院日韩av| 色播亚洲综合网| 中文在线观看免费www的网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 黄色视频,在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 在线a可以看的网站| 国国产精品蜜臀av免费| 免费看av在线观看网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线看三级毛片| 国产精品1区2区在线观看.| 免费高清视频大片| 最新在线观看一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 色精品久久人妻99蜜桃| 天堂网av新在线| 国产精品无大码| 日本 欧美在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美成人a在线观看| 欧美潮喷喷水| 午夜a级毛片| 久9热在线精品视频| 赤兔流量卡办理| 欧美bdsm另类| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 村上凉子中文字幕在线| 男女视频在线观看网站免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 18禁黄网站禁片免费观看直播| av视频在线观看入口| 国产av一区在线观看免费| 成人av一区二区三区在线看| 淫秽高清视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 精品久久久噜噜| 2021天堂中文幕一二区在线观| 色播亚洲综合网| 成人综合一区亚洲| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲无线观看免费| 草草在线视频免费看| 亚洲欧美日韩高清专用| 老司机深夜福利视频在线观看| 美女黄网站色视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一个人看视频在线观看www免费| 一a级毛片在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 成人二区视频| 国产视频一区二区在线看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲av不卡在线观看| 欧美日韩黄片免| 观看美女的网站| 国产高清三级在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 精品乱码久久久久久99久播| 一级av片app| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一区二区三区四区激情视频 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99精品久久久久人妻精品| 国内精品一区二区在线观看| 亚州av有码| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 中国美女看黄片| 在线播放无遮挡| 天堂√8在线中文| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区在线av高清观看| 干丝袜人妻中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜亚洲福利在线播放| 天堂影院成人在线观看| 午夜福利在线在线| 国模一区二区三区四区视频| 人人妻人人看人人澡| 久久精品国产清高在天天线| 桃色一区二区三区在线观看| 永久网站在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 人人妻人人看人人澡| 欧美精品国产亚洲| 欧美极品一区二区三区四区| 国内精品美女久久久久久| 一夜夜www| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 波野结衣二区三区在线| 日本免费a在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男女下面进入的视频免费午夜| 99riav亚洲国产免费| 老女人水多毛片| 国产精品无大码| 欧美成人一区二区免费高清观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美精品免费久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美黑人巨大hd| 91在线观看av| 亚洲自偷自拍三级| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本五十路高清| 国产人妻一区二区三区在| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩大尺度精品在线看网址| 99久久精品热视频| 在线看三级毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品不卡视频一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 国产老妇女一区| 免费观看人在逋| 色综合婷婷激情| 精品久久久久久久久av| 一本精品99久久精品77| 少妇丰满av| 成人二区视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲国产色片| 国产精品一区二区性色av| 一区二区三区免费毛片| 国产亚洲精品av在线| 久久久久久国产a免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产乱人伦免费视频| 深爱激情五月婷婷| 国产精品人妻久久久久久| 少妇的逼好多水| 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91精品国产九色| 国产男靠女视频免费网站| 一级黄片播放器| 欧美日韩黄片免| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 黄色配什么色好看| 我要搜黄色片| 成人永久免费在线观看视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日日夜夜操网爽| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 久久99热这里只有精品18| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本色播在线视频| 国产日本99.免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 久9热在线精品视频| 亚洲电影在线观看av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日本熟妇午夜| 欧美日韩乱码在线| 亚洲成av人片在线播放无| 精品久久久久久久久av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品,欧美在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 一a级毛片在线观看| 久久99热6这里只有精品| 日韩人妻高清精品专区| 给我免费播放毛片高清在线观看| av天堂中文字幕网| 国产精品久久久久久av不卡| 黄色一级大片看看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 男插女下体视频免费在线播放| 日本成人三级电影网站| 成人无遮挡网站| 小说图片视频综合网站| 久久久久九九精品影院| 麻豆成人av在线观看| 97热精品久久久久久| h日本视频在线播放| 亚洲精华国产精华精| 在线a可以看的网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产熟女欧美一区二区| 午夜老司机福利剧场| 欧美日韩综合久久久久久 | 如何舔出高潮| 午夜福利18| 色视频www国产| 成人三级黄色视频| 极品教师在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久99久视频精品免费| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美xxxx性猛交bbbb| 婷婷精品国产亚洲av在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 美女免费视频网站| 午夜福利成人在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| av黄色大香蕉| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一本精品99久久精品77| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩一区二区视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产免费男女视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费av不卡在线播放| 俺也久久电影网| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费在线观看成人毛片| 91av网一区二区| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲自偷自拍三级| 中文字幕高清在线视频| 我要搜黄色片| 精品福利观看| 久久久色成人|