小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷不同時間點基因表達(dá)譜的差異

黃凝　倉靜　薛張綱　王浩

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海　200032)

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·論著·

小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷不同時間點基因表達(dá)譜的差異

黃凝倉靜薛張綱王浩

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海200032)

摘要目的：探討小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷不同時間點基因表達(dá)譜的差異。方法： 建立小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷模型，收集再灌注4 h與24 h時缺血側(cè)與對照側(cè)腎臟組織標(biāo)本，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測各組標(biāo)本的基因表達(dá)水平，再結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析差異表達(dá)的基因種類(gene ontology，GO)與信號通路，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法驗證表達(dá)上調(diào)、下調(diào)與未變化的基因。結(jié)果：小鼠腎臟急性缺血再灌注24 h差異表達(dá)的基因數(shù)目多于再灌注4 h；再灌注4 h時的變化基因主要為代謝與應(yīng)激相關(guān)類型，24 h時的變化基因涉及炎性反應(yīng)與細(xì)胞凋亡等；再灌注4 h和24 h時，缺血再灌注引起的表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目均多于表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)目；隨機(jī)挑選的表達(dá)上調(diào)、下調(diào)與未變化基因可以被實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法驗證。結(jié)論：缺血再灌注損傷伴隨著大量基因表達(dá)的改變，缺血再灌注損傷不同時期的差異表達(dá)基因與病理生理變化密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞缺血再灌注；基因表達(dá)；小鼠腎臟

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)引起的組織損傷參與了包括心肌梗死、缺血性中風(fēng)、急性腎損傷、外傷、鐮狀紅細(xì)胞性貧血和睡眠呼吸暫停等多種病理過程，可引起多種疾病甚至導(dǎo)致死亡[1]。在外科手術(shù)中，IR損傷也是器官移植、心胸外科、大血管等手術(shù)過程中不容忽視的問題。

IR損傷是器官血供受限使組織灌注不足并持續(xù)一段時間后重新恢復(fù)灌注和氧供的過程。缺血期間器官能量供應(yīng)和需求間的不平衡直接造成組織缺氧和微循環(huán)功能紊亂；而隨后的再灌注過程則會引起固有和獲得性免疫應(yīng)答，并激活細(xì)胞死亡相關(guān)程序。因此IR損傷是多種細(xì)胞損傷機(jī)制相互作用的結(jié)果[2]。盡管缺血波及的范圍(全身性或區(qū)域性)、類型(熱缺血或冷缺血)及受損器官不同時，IR的形成機(jī)制間存在諸多差異，但仍有共同之處。在缺血期血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能會因缺氧而導(dǎo)致受損，引起血管通透性增加和漏出物增多。再灌注期重新恢復(fù)血供后，缺血器官并不可能立即恢復(fù)正常灌注(無復(fù)流現(xiàn)象)，缺血期微循環(huán)內(nèi)堆積的各種受損細(xì)胞組分會作為自身抗原激活抗體識別系統(tǒng)并活化補(bǔ)體系統(tǒng)[1]。盡管IR是在無菌環(huán)境內(nèi)發(fā)生，但仍然伴有固有和獲得性免疫應(yīng)答過程，并且活化的免疫系統(tǒng)會通過激活模式識別受體，輸送大量炎性細(xì)胞至受損器官參與損傷的形成[3]。此外，缺血及再灌注都可引起細(xì)胞凋亡、壞死和自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡等多種形式的細(xì)胞死亡[4]。

廣泛的基因表達(dá)變化也是IR損傷的一大特征。應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片或RNA-seq技術(shù)進(jìn)行的多項研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，IR伴隨大量基因轉(zhuǎn)錄水平的改變：腦組織IR過程中促炎因子、轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化酶等基因的mRNA增加，而離子通道、蛋白激酶等相關(guān)基因的mRNA減少；腎臟IR后促凋亡基因、轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)明顯增加，而細(xì)胞能量及生物合成相關(guān)酶的表達(dá)明顯降低。這些研究結(jié)果均表明IR伴有明顯的轉(zhuǎn)錄重編程過程。IR損傷過程中基因轉(zhuǎn)錄變化的調(diào)控機(jī)制也被廣泛研究。脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)對缺氧和炎性信號通路有重要影響，PHD的催化作用需要氧氣作為輔因子，因而對缺血缺氧尤為敏感。缺血期PHD的活性受抑制會增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子和核因子κB的穩(wěn)定性[9]。由于這2種轉(zhuǎn)錄因子參與了多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可引起廣泛的基因轉(zhuǎn)錄改變。近年來基因表達(dá)譜芯片與二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，為全面闡明這種廣泛的基因轉(zhuǎn)錄變化機(jī)制提供了契機(jī)。

IR過程伴隨的基因轉(zhuǎn)錄變化對基因的損傷與修復(fù)發(fā)揮重要作用。因此，本研究采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測小鼠腎臟IR后4 h與24 h的基因表達(dá)變化，分析早期和中期的基因表達(dá)差異，試圖為腎臟急性IR損傷的分子機(jī)制研究提供新線索。

1資料與方法

1.1小鼠腎臟急性IR損傷模型的建立選擇SPF級、4～6周齡、C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，操作均遵守復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗動物倫理管理委員會關(guān)于動物實驗的相關(guān)規(guī)定。選取20只小鼠以左側(cè)腎臟建立腎臟IR模型，右側(cè)腎臟接受假手術(shù)作為正常對照。同時將小鼠隨機(jī)分為2組，各10只，分別再灌注4 h和24 h后處死。所有小鼠均于標(biāo)準(zhǔn)實驗條件適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(70 mg/kg)實施麻醉。待鉗夾鼠尾無體動反應(yīng)后，將小鼠側(cè)臥位放置于恒溫?zé)粽丈涞氖中g(shù)平臺上，消毒備皮后，經(jīng)側(cè)腹部切口分別暴露雙側(cè)腎臟并將腎臟游離至切口外，以溫?zé)?.9%氯化鈉液浸潤的無菌紗布保護(hù)腎臟。分離出左側(cè)腎蒂，同時注意保護(hù)輸尿管，除去腎周筋膜后，以無損傷動脈夾夾閉腎蒂，通過觀察腎臟顏色變化確認(rèn)是否實現(xiàn)腎臟缺血。缺血40 min后松開動脈夾，觀察腎臟顏色恢復(fù)鮮紅則確認(rèn)再灌注成功。術(shù)中注意維持小鼠氣道通暢，并注意觀察小鼠呼吸頻率及趾端顏色，維持體溫于36～38 ℃，同時以0.9%氯化鈉液浸潤的無菌紗布保護(hù)切口及游離腎臟，減少液體丟失。手術(shù)結(jié)束后，回納腎臟并分層縫合切口。所有小鼠術(shù)后均存活。于再灌注4 h、24 h后脫頸處死動物，用0.9%氯化鈉液洗去血污，將腎臟組織即刻凍存于液氮或以4%甲醛溶液固定。IR側(cè)與對照側(cè)腎臟的組織切片與HE染色按常規(guī)病理切片染色操作進(jìn)行。

1.2小鼠腎臟RNA抽提和純化采用德國Qiagen公司的RNeasy Mini Kit抽提小鼠腎臟組織的總RNA，采用Nanodrop測定RNA濃度。

1.3小鼠腎臟基因表達(dá)譜芯片分析RNA樣品由上海其明信息技術(shù)有限公司進(jìn)行進(jìn)一步處理后采用Affymetrix Mouse Gene 1.0芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測。芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)化處理后得到各組的差異基因。對這些基因進(jìn)行基因種類(gene ontology，GO)與信號通路分析。

1.4實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain，RT-qPCR)采用日本Takara公司試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測，使用美國Bio-Rad公司PCR儀。引物序列：內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-GTGTTCCTACCCCCAATGTGT-3′，GAPDH 下游引物：5′-ATTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3′；Tet1上游引物：5′-CGAAAGAACAGCCACCAGAT-3′，Tet1下游引物：5′-TTGCTCTTCTTCCCCATGAC-3′；Tet2上游引物：5′-GTTGCAAGAAGAAAGCGGAG-3′，Tet2下游引物：5′-CTCTGCCCTTGCTGAAGGT-3′；Pank1上游引物：5′-CCGTACCCTATGTTGCTGGT-3′，Pank1下游引物：5′-GCCATGTCCAGAGCTTCTTC-3′；Arrb1上游引物：5′-CTCAAGCATGAGGACACGAA-3′，Arrb1下游引物：5′-TTAGGCTTGGGGTGCATTAG-3′；Dhcr24上游引物：5′-GTGTTGCCTGAGCTTGATGA-3′，Dhcr24下游引物：5′-TGAGTTTTCAGACGGTGTGC-3′；Cubn上游引物：5′-AGTCAGTCCTGGCTCCTTGA-3′，Cubn下游引物：5′-GTCTGGAGTGGTGGGGTAGA-3′；Cacnb2上游引物：5′-AGTCAGTCCTGGCTCCTTGA-3′，Cacnb2下游引物：5′-GTCTGGAGTGGTGGGGTAGA-3′；Ccl2上游引物：5′-AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3′， Ccl2下游引物：5′-TCTGGACCCATTCCTTCTTG-3′；Tgfrsf1a上游引物：5′-CAGTCTGCAGGGAGTGTGAA-3′; Tgfrsf1a下游引物：5′-CACGCACTGGAAGTGTGTCT-3′；Bdh1上游引物：5′-CGGCTAGTGGCAAAGCTATC-3′，Bdh1下游引物：5′-GTTGCAGACATTGAGCTGGA-3′；Upb1上游引物：5′-AATATGCCGTTCGCTTTTTG-3′，Upb1下游引物：5′-TCCCCCATGCTCTCTATCAC-3′；Pgam2上游引物：5′-ACACCTCCATCAGCAAGGAC-3′，Pgam2下游引物：5′-GGGCTGCAATAAGCACTCTC-3′；Idh1上游引物：5′-AGGTTCTGTGGTGGAGATGC-3′，Idh1下游引物：5′-GACGCCCACGTTGTATTTCT-3′；Oxgr1上游引物：5′-GGGAACAGAGGACACCAAGA-3′，Oxgr1下游引物：5′-GCCTCAGAAACTCTGCTGCT-3′；Atf3上游引物：5′-AGGCGGCGAGAAAGAAAT-3′，Atf3下游引物：5′-TCAATCTGGGCCTTCAGC-3′；Ngal上游引物：5′-CTGAATGGGTGGTGAGTGTG-3′， Ngal下游引物：5′-GGAGTGCTGGCCAAATAAGA-3′；Kim1上游引物：5′-AGCTCAGGGTCTCCTTCACA-3′，Kim1下游引物：5′-ACCACCCCCTTTACTTCCAC-3′；Cxcl10上游引物：5′-CCCACGTGTTGAGATCATTG-3′，Cxcl10下游引物：5′-CACTGGGTAAAGGGGAGTGA-3′；Ifngr2上游引物：5′-AGGCCCTTTCAAGAGCAACT-3′，Ifngr2下游引物：5′-CCAACGGAATCAGGATGACT-3′。

2結(jié)果

2.1小鼠腎臟IR模型建立HE染色結(jié)果顯示，IR側(cè)腎臟可見典型的IR的病理改變，表現(xiàn)為大量腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，小管細(xì)胞的刷狀邊緣缺失明顯，并伴有腎小管管腔的明顯擴(kuò)大和大量血細(xì)胞浸潤；IR側(cè)再灌注24 h腎臟的損傷比再灌注4 h更為嚴(yán)重。

2.2再灌注4 h和24 h時的基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果顯示再灌注4 h腎臟(設(shè)定變化1倍作為基因差異表達(dá)閾值)有84個基因表達(dá)上調(diào)、19個基因表達(dá)下調(diào)；再灌注24 h腎臟有161個基因表達(dá)上調(diào)、68個基因表達(dá)下調(diào)。無論是再灌注4 h還是24 h，表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目均多于表達(dá)下調(diào)基因數(shù)目；再灌注24 h表達(dá)發(fā)生變化的基因總數(shù)目多于再灌注4 h。GO分析結(jié)果顯示，再灌注4 h腎臟表達(dá)上調(diào)基因多與細(xì)胞應(yīng)激急性期反應(yīng)相關(guān)，下調(diào)基因與細(xì)胞代謝相關(guān)；Pathway分析結(jié)果顯示MAPK信號通路明顯活化，炎性反應(yīng)相關(guān)信號通路激活，而能量代謝及各種生物合成相關(guān)通路受到了顯著抑制。GO分析結(jié)果顯示，再灌注24 h腎臟表達(dá)上調(diào)基因與炎性反應(yīng)、凋亡及缺血損傷后修復(fù)過程密切相關(guān)，下調(diào)基因與細(xì)胞代謝相關(guān)，見圖1A、1B；Pathway 分析結(jié)果顯示，再灌注24 h以大量的炎性反應(yīng)相關(guān)信號通路活化為主；能量代謝信號通路抑制進(jìn)一步加劇，見圖 1C、1D。

2.3再灌注4 h與24 h差異表達(dá)基因的驗證RT-qPCR結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的靶基因mRNA 水平變化趨勢與基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)一致，見圖2。

3討論

IR損傷過程的基因轉(zhuǎn)錄重編程對損傷的發(fā)生和恢復(fù)均有重要意義[10]，因此，本研究全面檢測了IR損傷早期和中后期基因表達(dá)水平的差異。對再灌注后不同時間點(4 h和24 h)的差異基因分析顯示，從IR損傷的早期(再灌注4 h)到相對中后期(再灌注 24 h)轉(zhuǎn)錄重編程波及的基因逐漸增加。受到顯著影響的信號通路由應(yīng)激相關(guān)信號通路變?yōu)檠仔院兔庖叻磻?yīng)相關(guān)信號通路。這些變化特點和已發(fā)表的研究[8,11]結(jié)果一致，且與 IR損傷的演變過程相符。這些結(jié)果一方面驗證了 IR 中廣泛的基因轉(zhuǎn)錄變化，另一方面也從分子層面證實了動物模型的有效性。

本研究在不同時間點基因表達(dá)變化趨勢上得到了不同的結(jié)果。首先，再灌注4 h或 24 h后，表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目都遠(yuǎn)多于表達(dá)下調(diào)基因。為了減少動物個體差異對篩選表達(dá)差異基因的影響，本研究采用同一只動物左側(cè)腎臟接受IR處理，右側(cè)腎臟作為對照的方法。這種方法可能帶來的問題是：受到IR損傷的腎臟生成的一些炎性因子和分子信號物質(zhì)可能會通過血液循環(huán)影響對照側(cè)腎臟某些基因表達(dá)。但為避免動物個體差異可能對后續(xù)的基因組學(xué)分析帶來更大的干擾，本研究后續(xù)研究仍采取自身對照的策略。其次，再灌注24 h的差異基因數(shù)目多于再灌注4 h。這個結(jié)果提示腎組織受損程度隨著時間延長愈加嚴(yán)重，4 h受影響的基因多為立早基因，而24 h受影響的基因多為次級效應(yīng)導(dǎo)致。這些特點都動態(tài)地反映了再灌注后細(xì)胞對損傷應(yīng)答的變化，與IR損傷的發(fā)生過程非常吻合。最后，本研究基因表達(dá)譜芯片結(jié)果還鑒定出一些之前沒有被報道的表觀調(diào)控因子的表達(dá)變化(例如Tet1與Tet2)。

圖1A和B分別為再灌注24 h后表達(dá)上調(diào)/下調(diào)基因的GO分析(圖中所列為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的前15位基因類別)；C和D分別為再灌注24 h后表達(dá)上調(diào)/下調(diào)基因的Pathway分析(圖中所列為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的前10位信號通路)

A：表達(dá)上調(diào)基因，B：表達(dá)下調(diào)基因，C：表達(dá)無明顯變化基因；與對照側(cè)比較，*P<0.05 (Oxgr1:P=0.023; Tet1:P=0.035; Atf3:P=0.002; Kim1:P=0.011; Ngal:P=0.041)

圖2RT-qPCR驗證再灌注4 h組 Microarray基因變化趨勢

綜上所述，本研究檢測了急性IR損傷不同時間點小鼠腎臟基因表達(dá)譜的變化規(guī)律與差異，檢出了IR損傷早期和相對中后期的應(yīng)答基因。這些結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究IR損傷的分子機(jī)制研究提供了新的線索，可能為IR損傷的防治奠定了基礎(chǔ)。

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Stage-Specific Differences in Gene Expression of Mouse Kidneys Insulted by Ischemia Reperfusion Injury

HUANGNingCANGJingXUEZhanggangWANGHaoDepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To analyze the stage-specific differences in gene expression of mouse kidneys insulted by ischemia reperfusion(IR) injury. Methods:Mouse kidney tissues were collected at 4 h and 24 h after IR.Total RNA of control and IR kidneys were prepared for Microarray and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR) analysis. Results: The number of differential expressed genes(DEGs) at 24 h after IR was larger than that at 4 h.The DEGs at 4 h were associated with metabolism and stress responses,while the DEGs at 24 h were associated with inflammation and apoptosis.The numbers of up-regulated genes at both 4 h and 24 h were larger than those of down-regulated genes.Several down-regulated,up-regulated,or unchanged genes were confirmed by RT-qPCR. Conclusions: Stage-specific changes of gene expression occurres during IR injury.These DEGs at early or intermediate-late stages of IR injury are tightly associated with their stage-specific pathophysiological processes.

Key WordsIschemia reperfusion；Gene expression；Mouse kidneys

通訊作者王浩，E-mail：wang.hao2@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(編號：81301615)；上海市自然科學(xué)基金項目(編號：14ZR1406900)

中圖分類號R363

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A