狼瘡性腎炎患者HMGB1和RAGE的表達(dá)及意義

葉莉莉，徐星銘

狼瘡性腎炎患者HMGB1和RAGE的表達(dá)及意義

葉莉莉，徐星銘

摘要目的 探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在狼瘡性腎炎（LN）中的作用。方法 ELISA法檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者及正常對照者血清、尿液中HMGB1的表達(dá)水平，免疫組化法檢測SLE患者及正常對照者腎組織中HMGB1及RAGE的表達(dá)水平。結(jié)果 SLE患者血清及尿液的HMGB1水平與正常對照者比較均升高（P＜0.01），活動期SLE患者較穩(wěn)定期SLE患者明顯升高（P＜0.05）。狼瘡腎損害者血清HMGB1水平明顯高于狼瘡非腎損害者（P＜0.05）且與SLE疾病活動指數(shù)（SLEDAI）評分、24 h尿蛋白定量、白細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)性（P＜0.05），尿液中HMGB1水平與SLEDAI評分呈正相關(guān)性（P ＜0.05）。正常對照者腎組織腎小管上皮細(xì)胞可中等強度表達(dá)HMGB1和RAGE，腎小球未見表達(dá)；而在SLE患者可見腎小管中表達(dá)有所增強，腎小球中也明顯表達(dá)，其腎內(nèi)的HMGB1和RAGE的表達(dá)水平較正常對照者明顯增加（P＜0.05）；Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型SLE患者腎內(nèi)HMGB1的表達(dá)量均明顯高于Ⅱ型（P＜0.05），Ⅳ型SLE患者腎內(nèi)RAGE的表達(dá)量高于Ⅱ型（P＜0.05）。結(jié)論 HMGB1和RAGE可能參與了LN的發(fā)病過程，與疾病的病理變化有關(guān)。

關(guān)鍵詞系統(tǒng)性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；高遷移率族蛋白B1；晚期糖基化終產(chǎn)物受體

2014－12－13接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，合肥 230022

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機制主要是致病性自身抗體的產(chǎn)生、免疫復(fù)合物的沉積、細(xì)胞因子的激活，腎臟是最常見的受累器官之一，是SLE患者的主要死因。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）作為一種促炎細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎性細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌、免疫細(xì)胞的激活與遷移方面起著重要作用［1］。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是HMGB1的主要受體，兩者結(jié)合后通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)［2］。關(guān)于HMGB1和RAGE在狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）患者腎內(nèi)的表達(dá)罕見報道。該研究通過檢測HMGB1和RAGE在LN患者體內(nèi)水平，探討兩者與LN的病理及臨床關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 病例資料 收集2013年4月～2014年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科、風(fēng)濕科、皮膚科共64例SLE住院患者血清（其中47例患者同時留取尿液），男6例，女58例，年齡17～51（34.19± 9.17）歲。患者均符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用2000年SLE疾病活動指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI-2000）進行評分。收集10例門診健康體檢者（各生化指標(biāo)正常，自身抗體陰性，無糖尿病、高血壓、風(fēng)濕免疫等疾?。┑难搴湍蛞鹤鳛镾LE患者血清和尿液的正常對照，其中男1例，女9例，年齡19～40（31.50± 5.80）歲。64例患者中有25例經(jīng)腎活檢確診為LN（Ⅱ型6例、Ⅲ型4例、Ⅳ型10例、Ⅳ＋Ⅴ型5例）且每例腎組織切片中至少有8個腎小球。選取10例我院泌尿外科腎腫瘤切除患者遠(yuǎn)離腫瘤部位至少2 cm的腎組織作為SLE患者腎組織的正常對照，經(jīng)光鏡檢查腎組織無結(jié)構(gòu)及病理改變。該實驗入選對象均知情并簽署同意書，同時符合院倫理委員會要求。

1．2 主要試劑 HMGB1的ELISA試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司；兔抗人HMGB1多克隆抗體（bs-0664R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人RAGE多克隆抗體（bs-4999R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗試劑盒PV-9000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑、PBS緩沖液、正常山羊血清封閉液、檸檬酸鹽緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 方法

1．3．1 血清和尿液標(biāo)本采集及病理分型 SLE患者及正常對照者清晨空腹常規(guī)肘靜脈采血3 ml置于試管中。SLE患者尿液一般收集于首次入院后，正常對照者收集于門診的隨機尿，均以2 500 r／min離心10 min，分離血清置于－80℃冰箱保存待檢。腎活檢組織常規(guī)進行HE、PAS、Masson、PASM染色、免疫熒光，按2003年ISN及RPS標(biāo)準(zhǔn)行病理分型。

1．3．2 研究對象分組 SLE組：血標(biāo)本（n＝64）、尿標(biāo)本（n＝47）、腎組織標(biāo)本（n＝25），正常對照組：血標(biāo)本（n＝10）、尿標(biāo)本（n＝10）、腎組織標(biāo)本（n＝10）。SLE組患者采用SLEDAI-2000進行評分，≥10分為活動期，＜10分為穩(wěn)定期，故SLE組按疾病活動性分為活動期SLE組［血標(biāo)本（n＝47）、尿標(biāo)本（n＝33）］和穩(wěn)定期SLE組［血標(biāo)本（n＝17）、尿標(biāo)本（n＝14）］。SLE組以尿常規(guī)出現(xiàn)血尿（尿紅細(xì)胞數(shù)＞5個／HP）、管型尿或蛋白尿（24 h尿蛋白定量＞0.3 g或）為狼瘡腎損害，以無血尿、管型尿、蛋白尿（24 h尿蛋白定量＜0.3 g）為狼瘡無腎臟損害，故SLE組按尿常規(guī)結(jié)果分為狼瘡腎損害組［血標(biāo)本（n＝37）、尿標(biāo)本（n＝28）］和狼瘡非腎損害組［血標(biāo)本（n＝27）、尿標(biāo)本（n＝19）］。

1．3．3 臨床資料收集 收集患者的臨床指標(biāo)，包括血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、24 h尿蛋白定量、免疫球蛋白補體、SLEDAI評分等，詢問患者激素及免疫抑制劑的使用情況。

1．3．4 ELISA法檢測血、尿HMGB1水平 按試劑盒說明書操作。

1．3．5 免疫組化法檢測腎組織中HMGB1和RAGE石蠟切片脫蠟、水化、微波熱抗原修復(fù)、山羊血清孵育、加入一抗（HMGB1 1∶200，RAGE 1∶75）4℃冰箱過夜，次日滴加二抗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、返藍(lán)、脫水、封片。圖片使用Image Pro-Plus 6．0圖像分析軟件處理，以高倍鏡下平均光密度值代表患者腎內(nèi)HMGB1和RAGE表達(dá)水平。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩兩比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，指標(biāo)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 血清HMGB1水平及與臨床指標(biāo)的相關(guān)分析SLE患者血清HMGB1的平均水平顯著高于正常對照者［（70.22±11.08）μg／L vs（44.84±8.31）μg／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?；顒悠赟LE組顯著高于穩(wěn)定期SLE組［（71.61±11.01）μg／L vs （65.32±9.40）μg／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。狼瘡腎損害組顯著高于狼瘡非腎損害者［（73.99±11.17）μg／L vs（65.04±8.75）μg／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson線性相關(guān)分析顯示HMGB1水平與SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量、白細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)性（r＝0.26、0.55、0.26，P ＜0.05），見圖1。與抗雙鏈DNA抗體滴度、抗核抗體濃度、免疫球蛋白補體、C反應(yīng)蛋白、血小板無明顯相關(guān)性。

2．2 尿液HMGB1水平及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 SLE患者尿液HMGB1的平均水平顯著高于正常對照者［（60.53±5.80）μg／L vs（24.25±6.17）μg／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?；顒悠赟LE組顯著高于穩(wěn)定期組［（61.65±5.47）μg／L vs （57.89±5.90）μg／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。狼瘡腎損害組較狼瘡非腎損害組差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（61.17±5.56）μg／L vs（59.59±6.18）

μg／L］。Pearson相關(guān)分析提示尿液HMGB1水平與SLEDAI評分呈正相關(guān)性（r＝0.35，P＜0.05），與24 h尿蛋白定量、白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、抗雙鏈DNA抗體滴度、抗核抗體濃度、免疫球蛋白補體、C反應(yīng)蛋白無明顯相關(guān)性。見圖2。

2．3 HMGB1在腎組織中的表達(dá) HMGB1在正常對照者腎組織的腎小管上皮細(xì)胞可見中等程度表達(dá)，胞核表達(dá)為多，腎小球未見表達(dá)；而在SLE患者腎組織中，腎小管上皮細(xì)胞HMGB1的表達(dá)明顯增強，腎小球也出現(xiàn)中等強度表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外，與正常對照者腎組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表1。SLE組腎組織中HMGB1的平均光密度值比較，其中以Ⅱ型表達(dá)最弱，Ⅱ型較Ⅳ型和Ⅳ＋Ⅴ型相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　SLE患者與正常對照者腎組織內(nèi)HMGB1、RAGE表達(dá)水平（n，±s）

表1　SLE患者與正常對照者腎組織內(nèi)HMGB1、RAGE表達(dá)水平（n，±s）

與正常對照者比較：*P＜0.05；與Ⅱ型比較：＃P＜0.05

組別　n　HMGB1平均光密度值RAGE平均光密度值正常對照10　0．249 6±0．040 7　0．280 1±0．041 6 SLE　25　0．338 1±0．037 7*　0．351 1±0．033 2*Ⅱ型　6　0．301 2±0．036 7*　0．325 4±0．024 7*Ⅲ型　4　0．332 5±0．021 1*　0．360 2±0．038 7*Ⅳ型　10　0．354 6±0．027 4*?！?．368 8±0．033 1*＃Ⅳ＋Ⅴ型　5　0．353 9±0．041 9*?！?．339 4±0．015 2*

2．4 RAGE在腎組織中的表達(dá) RAGE在正常對照者腎小管上皮細(xì)胞中等強度表達(dá)，腎小球未見表達(dá)；在SLE患者腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)增強，腎小球也較強表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外，炎性浸潤區(qū)也可見明顯表達(dá)。見圖4。與正常腎組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。SLE組腎組織中RAGE的平均光密度值比較：Ⅱ型表達(dá)最輕，Ⅱ型較Ⅳ型相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

HMGB1是一種高度保守的染色質(zhì)蛋白，主要存

在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等［3］。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等受到刺激后可主動分泌HMGB1，組織細(xì)胞受損、凋亡、壞死后也可被動釋放HMGB1［4］。細(xì)胞外的HMGB1與細(xì)胞膜上特異性受體（如RAGE）結(jié)合，刺激炎性細(xì)胞的活化聚集，促進細(xì)胞因子（如IL-1、TNF-α等）的大量釋放，同時HMGB1做為一個內(nèi)源性免疫佐劑，對樹突狀細(xì)胞的成熟遷移、輔助性T細(xì)胞的極化起重要作用［5－6］。

本研究顯示SLE患者血清HMGB1水平顯著高于正常對照者，與研究［7］結(jié)果一致。穩(wěn)定期SLE組單核細(xì)胞等相對處于靜止?fàn)顟B(tài)，而活動期SLE組外周血中存在較多的促炎細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞相對活化，更多的HMGB1由細(xì)胞核分泌至細(xì)胞外。SLE患者SLEDAI評分越高，其狼瘡活動度就越高，免疫細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生隨之升高；活動期SLE組血清HMGB1水平明顯高于穩(wěn)定期SLE組，與SLEDAI評分呈正相關(guān)性。這與研究［8］結(jié)果一致，提示HMGB1參與了SLE的發(fā)病，與疾病的活動有關(guān)。

研究［9］顯示致病性抗雙鏈DNA抗體1A3F上調(diào)腎小球系膜細(xì)胞促炎癥反應(yīng)基因誘導(dǎo)狼瘡腎損害的主要作用機制與內(nèi)源性損傷分子HMGB1相結(jié)合有關(guān)，在抗雙鏈DNA抗體誘導(dǎo)的腎臟損害中，HMGB1作為一種促炎癥反應(yīng)的調(diào)停者，在LN的發(fā)病機制中至關(guān)重要。本實驗顯示狼瘡腎損害組血清HMGB1水平明顯高于狼瘡非腎損害組，且與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)性。同時本實驗還檢測了患者尿液中HMGB1的水平，顯示SLE患者尿液HMGB1水平顯著高于健康對照者，與研究［10］結(jié)果一致，尤以活動期SLE患者為甚，與SLEDAI評分呈正相關(guān)性，但并未表明其在狼瘡腎損害者與狼瘡非腎損害者之間的差異，有待進一步探究。研究［11］顯示HMGB1不僅在LN大鼠的血清中升高，在腎組織中可見顯著表達(dá)，本研究對不同病理類型SLE患者腎組織中的HMGB1表達(dá)進行免疫組化檢測顯示在正常對照者腎小管上皮細(xì)胞可見中等強度表達(dá)，而在SLE患者腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)增強，腎小球也出現(xiàn)較強表達(dá)，其中Ⅱ型的表達(dá)量較輕，Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型的表達(dá)量較為嚴(yán)重，提示HMGB1可能參與了LN的病理發(fā)展過程。

研究［2］顯示HMGB1與其主要受體RAGE相結(jié)合激活NF-κB途徑，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)；在RAGE基因敲除鼠中其炎癥因子的分泌下降70%［12］，這說明HMGB1的促炎作用在很大程度上依賴RAGE。本研究顯示正常對照者的腎組織中腎小球未見RAGE的表達(dá)，腎小管中度表達(dá)；而在SLE患者中腎小球、腎小管均強表達(dá)，且Ⅱ型表達(dá)較輕，Ⅳ型最強，在LN病變中以Ⅰ型、Ⅱ型為輕，Ⅳ型最重，RAGE在不同病理類型LN腎組織的表達(dá)程度與LN的病理嚴(yán)重度相當(dāng)，提示RAGE可以作為預(yù)測LN病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。

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Expression and significance of HMGB1and RAGE in patients with lupus nephritis

Ye Lili，Xu Xingming
（Dept of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the role of high mobility group box protein 1（HMGB1）and receptor for advanced glycation endproducts（RAGE）in lupus nephritis（LN）．Methods The serum and urine levels of HMGB1 were detected by ELISA in SLE patients and normal controls，and intrarenal expressions of HMGB1 and RAGE were detected by immunohistochemistry in renal tissues of SLE patients and normal-appearing renal tissues．Results The serum and urine levels of HMGB1 were significantly higher in SLE patients compared to healthy controls（P ＜0.01），in patients with active disease compared to those with inactive disease（P＜0.05），serum levels of HMGB1 were found to be significantly higher in patients with renal involvement compared to those without renal involvement（P＜0.05）．In addition，the levels of serum HMGB1 showed positive correlation with SLEDAI，urine protein（24 h）and lencocyte count（P＜0.05）．The expression of urine HMGB1 showed positive correlation with SLEDAI（P＜0.05）．Intermediate-intensity staining of HMGB1 and RAGE was detected in renal tubules in normalappearing renal tissues，however，both renal tubules and glomerular cells had the strong expression of HMGB1 and RAGE in SLE patients．The intrarenal production of HMGB1 and RAGE in SLE patients was obviously higher than that in normal-appearing renal tissues（P＜0.05），and the expression levels of HMGB1 in SLE IV and IV＋V were higher than those in SLE II（P＜0.05）．The expression levels of RAGE in SLE IV were higher than those in SLE II（P＜0.05）．Conclusion HMGB1 and RAGE may play key roles in the pathogenesis of LN and may associate with the pathology category of LN．

Key wordssystemic lupus erythematosus；lupus nephritis；high mobility group box protein 1；advanced glycation endproducts

作者簡介：葉莉莉，女，碩士研究生；徐星銘，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xxm2425＠163．com

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0533－05

中圖分類號R 593．242