綿羊BMP15基因特征、組織表達(dá)及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

劉世佳，潘香羽，李發(fā)弟,，王維民,,李廷福

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)

工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤　733300)

綿羊BMP15基因特征、組織表達(dá)及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

劉世佳1，潘香羽1，李發(fā)弟1,2，王維民1,2,李廷福2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)

工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤733300)

摘要：為了解綿羊BMP15基因序列特征和組織表達(dá)特征，SNP篩查及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)性分析，采用生物信息學(xué)方法分析綿羊BMP15基因序列特征；利用qRT-PCR檢測(cè)BMP15基因在‘湖羊’下丘腦、垂體、心等13個(gè)組織中mRNA的分布；通過測(cè)序驗(yàn)證了綿羊BMP15基因B2突變位點(diǎn)并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析.結(jié)果表明：綿羊BMP15基因ORF全長(zhǎng)1 377 bp，編碼393個(gè)氨基酸殘基，包括transforming growth factor-beta (TGF-beta) 家族和低復(fù)雜性區(qū)段(low complexity region).Protfun分析結(jié)果顯示，綿羊BMP15基因作為激素參與生物學(xué)過程的可能性最高.綿羊BMP15基因在公羊十二指腸中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，而在母羊中，卵巢組織的表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05).B2突變位點(diǎn)于BMP15基因編碼區(qū)外顯子Ⅱ的第718 bp處，該突變?yōu)镃→T突變.綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：該位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，其中G+型綿羊產(chǎn)羔數(shù)為(2.00±0.78)，顯著高于++型綿羊產(chǎn)羔數(shù)(P<0.05)，為(1.38±0.54).綿羊BMP15基因B2突變位點(diǎn)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，可用作為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的分子標(biāo)記應(yīng)用于育種.

關(guān)鍵詞：綿羊； BMP15；基因特征；基因表達(dá)；產(chǎn)羔數(shù)

第一作者：劉世佳(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)椴菔硠?dòng)物生產(chǎn).E-mail：450110252@qq.com

Characteristics and expression ofBMP15 gene

and its association with litter size in sheep

LIU Shi-jia1，PAN Xiang-yu1，LI Fa-di1,2，WANG Wei-min1,2，Li Ting-fu2

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Engineering

Laboratory of Sheep Breeding and Reproduction Biotechnology in Gansu Province,Minqin 733300,China)

Abstract：This study was performed to comprehend the sequence and tissue expression characteristics of BMP15 gene,and the relationship between mRNA expression level of BMP15 gene in different tissues and litter size in sheep.The sequence of BMP15 gene in sheep was obtained from NCBI.The tissue distributions of BMP15 were detected by RT-PCR in 13 tissues such as the heart,hypothalamus and pituitary in sheep.The sheep's BMP15 gene SNP loci were searched by sequencing,and their correlation with the litter size were analyzed.The results showed that the ORF length of BMP15 gene was 1 377 bp,encoding 393 amino acids which included some typical domains such as transforming growth factor-beta (TGF-beta) family and low complexity region.The result of Protfun showed that the possibility of BMP15 gene in sheep act as hormone in biological processes was the highest.RT-PCR assays revealed that BMP15 highly expressed in the hypothalamus tissue in ram(P<0.05) and highly expressed in the ovary of ewe(P<0.05).The BMP15 gene polymorphism was associated with the litter size which showed that the litter size of G+ was 2±0.773 4,the litter size of ++ was 1.380 5±0.541 3,and the allele G could increase 0.62 average litter size.The BMP15 gene was involved as hormone in the process that regulating the sheep breeding,it could be used as a molecular marker for raising sheep litter size.

Key words：sheep;BMP15;genetic characteristics;gene expression;litter size

綿羊產(chǎn)羔數(shù)是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，決定舍飼養(yǎng)羊的效益[1].影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因成為了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)之一.有文獻(xiàn)報(bào)道，綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15，BMP15)基因是影響產(chǎn)羔數(shù)的主效基因之一[2-4].BMP15基因有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，外顯子1長(zhǎng)324 bp，外顯子2長(zhǎng)855 bp，中間隔著5 400 bp的內(nèi)含子，編碼393個(gè)氨基酸殘基前蛋白，其成熟活性肽為125個(gè)氨基酸[5-6].1991年首先在‘Romney’羊上發(fā)現(xiàn)的BMP15被稱為GDF-9B(growth differentiation factor 9B，GDF-9B)，是TGF(transforming growth factor，TGF)家族成員之一，位于綿羊X染色體上，在卵巢內(nèi)僅在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，其編碼產(chǎn)物在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要作用[7-8].BMP15是由卵母細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子，對(duì)早期卵泡的生長(zhǎng)和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用[9-16].BMP15基因編碼區(qū)外顯子Ⅱ第718 bp處發(fā)生了C→T突變，這一突變?cè)诼殉矁?nèi)通過使顆粒細(xì)胞早熟及卵泡體積變小增加排卵數(shù)，是造成產(chǎn)羔數(shù)增加的一個(gè)重要基因[12].Hanrahan等將BMP15基因外顯子Ⅱ第718處堿基突變(C→T)命名為B2突變；同時(shí)將Belclare綿羊的BMP15基因1 100處的堿基突變(G→T)命名為B4突變.儲(chǔ)明星等[17-18]采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)低繁殖力綿羊品種(‘陶賽特羊’‘特克塞爾羊’‘德國(guó)肉用美利奴羊’)中的單核苷酸多態(tài)性，同時(shí)研究BMP15基因B2突變對(duì)小尾寒羊高繁殖能力的影響，結(jié)果表明BMP15基因的B2突變對(duì)小尾寒羊高繁殖能力的影響作用十分顯著.以上研究報(bào)道表明，BMP15基因在母畜繁殖過程中起重要作用，但目前有關(guān)綿羊BMP15基因結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)分布的研究尚未見報(bào)道，且其對(duì)產(chǎn)羔數(shù)遺傳特性的機(jī)理有待進(jìn)一步研究.本研究擬采用RT-PCR的方法分離綿羊BMP15基因，利用生物信息學(xué)軟件分析其結(jié)構(gòu)并對(duì)功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用real-time PCR方法分析綿羊BMP15基因在不同組織中的表達(dá)差異，利用PCR-RFLP方法對(duì)BMP15基因進(jìn)行與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)性的分析，以期為研究影響綿羊高繁殖力的機(jī)理提供基因素材.

1材料與方法

1.1用于組織表達(dá)譜分析的組織樣

用于組織表達(dá)譜研究的組織樣取自民勤中天羊業(yè)有限公司勤鋒灘種羊場(chǎng)的各3只成年‘湖羊’公羊和母羊，組織樣包括心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、十二指腸、肌肉、脂肪、下丘腦、垂體、睪丸、卵巢等13種組織.

1.2用于性狀關(guān)聯(lián)分析的DNA樣品

用于性狀關(guān)聯(lián)分析的試驗(yàn)羊群是由我室與民勤中天羊業(yè)有限公司合作組建的，包括‘湖羊’(85只)、‘小尾寒羊’(345只)、‘美利奴’(♂)ב湖羊’(♀)(48只)，共478只.收集單胎產(chǎn)羔記錄.試驗(yàn)羊只的單胎產(chǎn)羔數(shù)均來自第1和第2胎.采集血液，按酚/氯仿法提取基因組DNA.

1.3組織總RNA提取與RT-PCR反應(yīng)

采用TransZol(TransGen Biotech)提取組織總RNA，具體操作方法見說明書.采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen Biotech)對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

RT反應(yīng)體系為20 μL：2 μL RNA，1 μL oligo(dT)18，10 μL 2×TS Reaction Mix，1 μL TS Enzyme Mix，1 μL gDNA Remover，5 μL RNase-free Water，輕輕混勻后于PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，獲得cDNA第1鏈.全程操作在冰上進(jìn)行.

PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×EasyTaqPCR Super Mix，上下游引物各0.8 μL(10 μmol/L，表1)，1 μL cDNA，10 μL ddH2O.反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min.進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，同時(shí)以不加模板的體系作對(duì)照，以排除試劑污染和基因組DNA污染引起假陽(yáng)性的可能.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物.

1.4引物設(shè)計(jì)

根據(jù)綿羊BMP15基因序列(NC_019484.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以混合DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中BMP15基因序列(NC_019484.1)進(jìn)行比對(duì)，用于RFLP分析；根據(jù)綿羊BMP15基因mRNA序列(NM_001114767.1 )，用于Real-time qPCR分析；以看家基因GAPDH(NM_001190390)作為內(nèi)參基因.所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成(表1).

表1　綿羊BMP15和GAPDH基因特異性引物的參數(shù)

1.5SNP篩查與基因型檢測(cè)

1.5.1SNP位點(diǎn)篩查為研究綿羊BMP15基因多態(tài)性，根據(jù)其DNA序列(NC_019484.1)設(shè)計(jì)引物(表1)，擴(kuò)增‘湖羊’和‘杜泊羊’2個(gè)品種的基因組DNA.每個(gè)品種選取8個(gè)個(gè)體的混合DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將PCR產(chǎn)物純化回收直接送上海桑尼生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序并參考文獻(xiàn)中BMP15基因外顯子Ⅱ第718處堿基(C→T)的突變?cè)O(shè)計(jì)SNP位點(diǎn).

1.5.2基因型檢測(cè)用上述表1中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng).擴(kuò)增體系如下：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.8 μL，ddH2O 9.9 μL，DNA模板1 μL.用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.限制性內(nèi)切酶為BsiEⅠ，酶切體系如下：酶切反應(yīng)體系為15 μL，其中PCR產(chǎn)物5 μL，10×buffer 1.5 μL，10 U/μLBsiEⅠ限制性內(nèi)切酶1.0 μL，去離子水7.5 μL.振蕩、短暫離心(12 000 r/min)，酶切反應(yīng)條件為60 ℃恒溫孵育30 min.取酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果并拍照.

1.6基因型與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析

本研究進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析所用的是SAS(視窗V8版)軟件中的廣義線性模型(general linear model，GLM)程序，并采用方差分析的最小二乘分析法進(jìn)行分析的.具體的線性模型：

Yijkl=μ+Genotypei+Breedi+Pk+Si+Combinationm+εijklm

式中，Yijkl是性狀觀察值，μ為總體平均數(shù)，Genotypei為基因型效應(yīng)，Breedj為品種效應(yīng)，Pk為胎次效應(yīng)，Si為季節(jié)效應(yīng)，Combinationl為組合的效應(yīng)，εijkl為隨機(jī)誤差，假定εijkl相互獨(dú)立，服從N(0，σ2)分布.

1.7BMP15基因編碼蛋白的序列分析

BMP15基因編碼產(chǎn)物開放閱讀框采用NCBI的ORF Finder程序分析；理化性質(zhì)采用DNAStar分析軟件預(yù)測(cè)；多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析采用DNAMAN軟件分析，其中用于比對(duì)的編碼區(qū)序列來源于美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)，GenBank登錄號(hào)分別為：牛(NM_001031752.1)、雞(NM_001006589.2)、家犬(XM_003640274.2)、人(NM_005448.2)、綿羊(NM_001114767.1)、家鼠(NM_009757.4)、野豬(NM_001005155.1)、山羊(XM_005700729.1)、獼猴(XM_001083980.2)、黑猩猩(XM_529247.2)、斑馬魚(NM_001020484.1)；功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)，功能預(yù)測(cè)采用Protfun分析軟件.

1.8Q-PCR分析

使用Roche LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析每個(gè)樣品的BMP15基因的表達(dá)，使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照.使用20 μL的擴(kuò)增體系：10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)，0.4 μL下游引物(10 μmol/L，表1)，1 μL cDNA，8.2 μL ddH2O，混合樣品.擴(kuò)增條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，63 ℃退火15 s， 72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件為：95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s；陰性對(duì)照用1 μL ddH2O代替模板.試驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣品檢測(cè)進(jìn)行4個(gè)技術(shù)重復(fù).

1.9數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

2.1綿羊BMP15基因編碼區(qū)序列分析

2.1.1綿羊BMP15基因開放閱讀框分析(open reading frame，ORF) 本研究采用NCBI的ORF Finder程序，尋找出1條長(zhǎng)1 377 bp的ORF(圖1)，起始密碼子位于1 bp處，終止密碼子位于1 181 bp處，編碼393個(gè)氨基酸殘基.

圖1　綿羊BMP15基因序列的ORF分析

2.1.2BMP15編碼產(chǎn)物序列同源性及進(jìn)化樹分析同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，綿羊BMP15基因編碼區(qū)核苷酸序列與人、黑猩猩、家鼠、家犬、豬、山羊和牛等哺乳動(dòng)物的一致性分別為81.57%、81.73%、77.83%、87.34%、90.30%、99.07和98.31%，但與斑馬魚的一致性僅為47.70%，說明哺乳動(dòng)物BMP15基因核苷酸序列比較保守.

綿羊BMP15基因編碼蛋白含有393個(gè)氨基酸殘基(圖2)，與人、黑猩猩、家鼠、家犬、豬、山羊和牛等哺乳動(dòng)物的一致性分別為73.16%、73.42%、68.45%、81.98%、87.31%、98.48%和97.97%，但與斑馬魚的一致性僅為28.57%，可見哺乳動(dòng)物BMP15蛋白比較保守.

紅色雙下劃線標(biāo)記(從292位至393位)表示transforming growth factor-beta (TGF-beta) 家族.

2.1.3綿羊BMP15基因功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 采用SMART程序?qū)d羊BMP15基因編碼序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：在綿羊BMP15基因氨基酸序列的2～16位和292～393位分別發(fā)現(xiàn)了低復(fù)雜性區(qū)段(low complexity region)和Transforming growth factor-beta (TGF-beta)家族.

2.1.4綿羊BMP15基因功能預(yù)測(cè)本研究通過Protfun分析軟件預(yù)測(cè)BMP15編碼產(chǎn)物的功能，從結(jié)果分析可知(表2)，該蛋白主要作為激素，應(yīng)激反應(yīng)和生長(zhǎng)因子的功能，可能性分別為1.05,0.802,0.65，由此推斷BMP15可能作為生長(zhǎng)因子在生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用.

圖3　綿羊BMP15基因編碼序列功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

GO功能類別幾率激素1.050應(yīng)激反應(yīng)0.802生長(zhǎng)因子0.650信號(hào)傳感器0.487轉(zhuǎn)錄調(diào)控0.475免疫反應(yīng)0.445轉(zhuǎn)錄0.401受體0.375運(yùn)載體0.225離子通道0.215結(jié)構(gòu)蛋白0.181金屬離子轉(zhuǎn)移0.020

2.2綿羊BMP15基因的PCR-RFLP與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)性分析

2.2.1PCR擴(kuò)增由圖4可見，在100 bp附近有1條特異性片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，可以進(jìn)行RFLP分析.

2.2.2SNP篩查由圖5可知，在G+基因型中箭頭所指處出現(xiàn)了C和T 2種堿基的雙峰.由此可以推測(cè)在BMP15基因上發(fā)現(xiàn)了g.718C>T突變位點(diǎn).

2.2.3綿羊BMP15基因的PCR-RFLP用HinfI限制性內(nèi)切酶對(duì)BMP15基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同個(gè)體的結(jié)果表現(xiàn)出2種不同的基因型，分別為G+，++.

M:DL2000 Marker；1～10：BMP15基因PCR擴(kuò)增

圖4BMP15基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.4PCR amplification of BMP15 gene

圖5　綿羊BMP15基因的混合DNA測(cè)序結(jié)果

M:DL2000 Marker；3～4：G+型；2、5、6、7：++型.

圖6綿羊BMP15基因PCR-RFLP電泳圖譜

Fig.6PCR-RFLP Electrophoresis pattern of

BMP15gene of sheep

2.2.4綿羊BMP15基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘分析綿羊BMP15基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤見表3.

表3　綿羊BMP15基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

*代表顯著(P<0.05)，**代表極顯著(P<0.01).

2.3綿羊BMP15基因的組織表達(dá)譜分析

采用RT-PCR 技術(shù)對(duì)湖羊心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、十二指腸、下丘腦、睪丸、卵巢、脂肪、背最長(zhǎng)肌、垂體等13 個(gè)組織BMP15基因mRNA 的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP15基因在湖羊這13個(gè)組織中均有表達(dá)(圖7～8).灰度分析發(fā)現(xiàn)綿羊BMP15基因在公羊十二指腸中表達(dá)水平最高，顯著高于羊心、肝、肺、脾、腎、瘤胃、十二指腸、下丘腦、睪丸、脂肪、背最長(zhǎng)肌、垂體組織(P<0.05)，在母羊卵巢中表達(dá)水平最高，顯著高于羊心、脾、瘤胃、十二指腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌、垂體組織(P<0.05).

用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)綿羊BMP15基因在12個(gè)組織中表達(dá)量進(jìn)行定量分析，熔解曲線如圖9，目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值非常均一，熔解曲線上呈明顯單峰，表明在Q-PCR過程中，熒光強(qiáng)度來源于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，該基因及內(nèi)參基因沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體.Q-PCR結(jié)果顯示，綿羊BMP15基因在公羊十二指腸組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織的表達(dá)量(P<0.05，圖10),在母羊卵巢組織中的表達(dá)量極顯著高于心、脾、瘤胃、十二指腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌、垂體組織的表達(dá)量(P<0.05，圖11).

1：心；2：肝；3：脾；4：肺；5：腎；6：瘤胃；7：十二脂腸；8：下丘腦；9：睪丸；10：肌肉；11：脂肪；12：垂體.

圖7綿羊公羊BMP15基因在12種

組織的RT-PCR電泳圖譜

Fig.7RT-PCR Electrophoresis pattern of BMP15

gene in 12 tissues of sheep in ram

1：心；2：脾；3：肺；4：腎；5：瘤胃；6：下丘腦；7：十二脂腸；8：脂肪；9：肌肉；10：卵巢；11：肝；12：垂體.

圖8綿羊母羊BMP15基因在12種組織

的RT-PCR電泳圖譜

Fig.8RT-PCR Electrophoresis pattern of BMP15

gene in 12 tissues of sheep in ewe

圖9　綿羊BMP15基因和內(nèi)參基因的熔解曲線

3討論

3.1關(guān)于綿羊BMP15基因結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)分析

本研究通過NCBI中ORF Finder 分析，找到1條1 377 bp的ORF[19].通過與人、小鼠、牛、牦牛、山羊等11個(gè)物種的BMP15基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)綿羊BMP15基因與山羊BMP15基因同源性最高，該基因在物種間高度保守.利用SMART軟件在綿羊BMP15基因編碼的氨基酸序列的2～16位和292～393位分別發(fā)現(xiàn)了低復(fù)雜性區(qū)段(low complexity region)和Transforming growth factor-beta (TGF-beta)家族.Transforming growth factor-beta (TGF-beta)是一種在許多細(xì)胞類型中控制細(xì)胞增殖、分化和其他功能的一種多功能肽.TGF-beta-1是一種由前體蛋白在氮端裂解產(chǎn)生的有112氨基酸殘基的肽[20].許多蛋白質(zhì)都與TGF-beta-1有關(guān)[21-22].來自TGF-beta家族的蛋白只有在作為同質(zhì)或異質(zhì)二聚體時(shí)有活性.調(diào)節(jié)因子TGF-beta發(fā)揮抑制腫瘤的作用，還能調(diào)控細(xì)胞入侵和免疫調(diào)節(jié)[23].TGF-beta的錯(cuò)誤調(diào)控會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展.通過Protfun軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，該蛋白主要具有激素、應(yīng)激反應(yīng)和生長(zhǎng)因子的功能，與上述功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)中所得到的TGF-beta 結(jié)構(gòu)域的功能是一致的.因此，推測(cè)綿羊BMP15基因可能作為激素和生長(zhǎng)因子參與免疫、應(yīng)激和生長(zhǎng)發(fā)育等調(diào)控過程.

綿羊12種組織BMP15基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，相同小寫字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示顯著(P<0.05).

圖10綿羊BMP15基因在公羊各組織的表達(dá)

Fig.10The mRNA expression profile of BMP15

gene in various tissues of ram

綿羊12種組織BMP15基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，相同小寫字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示顯著(P<0.05).

圖11綿羊BMP15基因在母羊各組織的表達(dá)

Fig.11The mRNA expression profile of BMP15

gene in various tissues of ewe

3.2關(guān)于綿羊BMP15基因在不同組織中的表達(dá)

Galloway等證實(shí)BMP15基因的mRNA僅在卵母細(xì)胞中表達(dá)，BMP15蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中是不可缺少的蛋白[12,14].Otsuka等報(bào)道了BMP15的2個(gè)重要功能：通過抑制顆粒細(xì)胞上的促濾泡生長(zhǎng)激素(FSH)受體表達(dá)，BMP15抑制了促卵泡素的表達(dá)；BMP15能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，在卵泡發(fā)育早期起著非常重要的作用[24].該基因在未成熟卵母細(xì)胞中表達(dá)水平較低，在培養(yǎng)12 h其表達(dá)豐度達(dá)到峰值，并與卵丘擴(kuò)展時(shí)間相一致，隨后下降，推測(cè)BMP15可能在山羊卵丘細(xì)胞擴(kuò)展中發(fā)揮重要作用.從而驗(yàn)證了BMP15基因在山卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用.該基因在公畜中未見研究報(bào)道.本研究利用Q-PCR技術(shù)，探討了BMP15基因在公羊與母羊不同組織中mRNA表達(dá)差異，結(jié)果顯示該基因在十二指腸組織和卵巢的表達(dá)量顯著高于其他組織，表明綿羊BMP15基因可能在十二指腸和卵巢中發(fā)揮功能，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

3.3關(guān)于綿羊BMP15基因與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

楊燕燕等以蒙古羊單羔群體(18只)、多胎類型小尾寒羊(30只)為對(duì)照組對(duì)蒙古羊雙羔群體(50只)進(jìn)行了BMP15基因的遺傳多態(tài)性分析，采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)BMP15的FecXI位點(diǎn)突變進(jìn)行多態(tài)性分析；采用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記PCR-SSCP技術(shù)對(duì)BMP15的B1位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明：BMP15的FecXI位點(diǎn)不是影響‘蒙古羊’和‘小尾寒羊’多胎性狀的主效基因；在3種群體中存在相應(yīng)的B1突變28～30 bp(CTT缺失)，并發(fā)現(xiàn)了3種基因型，‘蒙古羊’雙羔群體3種基因型頻率分別0.020(++)，0.940(B+)，0.040(BB)；‘蒙古羊’單羔群體只檢測(cè)到了兩種基因型，基因型頻率分別是0.722(++)，0.278(BB)；小尾寒羊群體中3種基因型頻率分別是0.300(++)，0.667(B+)，0.033(BB).B+基因型‘蒙古羊’平均產(chǎn)羔數(shù)比++基因型多0.83只，差異極顯著(P<0.01)，推斷BMP15的B1突變有可能是控制‘蒙古羊’多胎性能的主效基因；‘小尾寒羊’群體中3種基因型母羊平均產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著(P>0.05)[25].Galloway等研究發(fā)現(xiàn)BMP15基因的突變(V31D和Q23Ter)與‘Inverdale’和‘Hanna’2個(gè)綿羊品種雜合攜帶母羊的高排卵數(shù)和純合子不育相關(guān)聯(lián)[12].Hanrahan等研究發(fā)現(xiàn)‘Belclare’和‘Cambridge’綿羊的B2突變純合子是不育的；當(dāng)BMP15基因野生純和時(shí)，‘Belclare’母羊排卵數(shù)為(1.92±0.28)枚(n=11),‘Cambridge’母羊排卵數(shù)為(2.27±0.49)枚(n=10)；當(dāng)BMP15基因突變?yōu)殡s合子時(shí)，‘Belclare綿羊’和‘Cambridge綿羊’排卵數(shù)都增加，B2突變(C→T)雜合型‘Belclare綿羊’和‘Cambridge綿羊’排卵數(shù)分別為(2.69±0.48)枚(n=4)、(3.11±0.44)枚(n=15)[26].由此推測(cè)，BMP15基因可能是影響綿羊產(chǎn)仔數(shù)的候選基因，其基因效應(yīng)與綿羊品種有關(guān).品種間基因組的堿基變異位點(diǎn)可能成為種群間的多態(tài)位點(diǎn)，這對(duì)于動(dòng)物育種及其生產(chǎn)有重要意義.本研究在綿羊BMP15基因發(fā)現(xiàn)的B2突變位點(diǎn)，性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：該位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)(P<0.05)，G+型最小二乘平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤為(2.00±0.77)，++型為(1.38±0.54)，G+型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于++個(gè)體(P<0.05).因此，綿羊BMP15基因可作為提高母羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記.

4結(jié)論

功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，綿羊BMP15基因作為激素的幾率最高，推測(cè)該基因可能作為一種重要的生長(zhǎng)因子參與調(diào)控機(jī)體的生物學(xué)過程.

綿羊BMP15基因在公、母羊中表達(dá)量最高的組織分別為十二指腸和卵巢，推測(cè)在母羊中卵巢可能是BMP15基因作用的主要靶器官之一.

綿羊BMP15基因多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)聯(lián)分析顯示，BMP15基因B2突變與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，可作為提高母羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記應(yīng)用于育種.

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-28；修回日期：2014-06-04

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-39)；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD28B05);甘肅省科技重大專項(xiàng)(1102NKDH023).

通信作者：王維民，男，講師，主要從事綿羊遺傳育種與繁殖.E-mail：wangwm@gsau.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2015)03-0040-09