葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶工藝的條件優(yōu)化

李潁，郭曉，張彥芳，馬滕臻，張莉，祝霞，韓舜愈，楊學(xué)山

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，

甘肅 蘭州　730070)

葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶工藝的條件優(yōu)化

李潁1，郭曉2，張彥芳1，馬滕臻1，張莉1，祝霞1，韓舜愈1，楊學(xué)山2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，

甘肅 蘭州730070)

摘要：以葡萄酒泥酵母為試驗材料，采用單因素和正交試驗設(shè)計，優(yōu)化酵母細(xì)胞自溶的工藝條件.結(jié)果表明：在溫度47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH 4.5，處理時間33h的最優(yōu)條件下，酵母自溶前后電導(dǎo)率增加2.49 ms/cm，氨基氮含量增加2.154 90 mg/mL，自溶效果最好.此方法成本低，易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn).

關(guān)鍵詞：葡萄酒泥酵母；自溶；電導(dǎo)率；氨基氮

第一作者：李潁(1988-)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及利用.E-mail:16088164@qq.com

Optimization of processing techniques for autolysis of

yeast cell from waste wine yeast

LI Ying1,GUO Xiao2,ZHANG Yan-fang1,MA Teng-zhen1,ZHANG Li1,

ZHU Xia1,HAN Shun-yu1,YANG Xue-shan2

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.College of

Life Science & Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：The main factors that influence autolysis of yeast cell were screened by single factor and orthogonal tests.The results showed that the optimal temperature was 47.5 ℃,the mass fraction of NaCl was 2%,pH was 4.5,react time was 33 h.Under these conditions,obtained extract's conductivity increased 2.49 ms/cm,amino nitrogen content increased 2.15 490 mg/mL after autolysis.The process was inexpensive and simple and could be applied to industrialized production.

Key words：wine yeast;autolysis;conductivity;amino nitrogen

葡萄酒泥酵母是葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中主要的副產(chǎn)物[1]，每生產(chǎn)100 kL的葡萄酒，可形成2.5～4.0 t的葡萄酒泥酵母[2].酵母細(xì)胞富含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是功能性食品添加劑的重要來源之一[3].在實際生產(chǎn)中，大多數(shù)企業(yè)將酒泥酵母直接丟棄，不僅浪費(fèi)了寶貴的生物資源，而且造成了環(huán)境污染.因此，急需開展葡萄酒泥酵母資源化利用研究.

利用葡萄酒泥酵母可開發(fā)超氧化物歧化酶等活性物質(zhì)[4]，但對細(xì)胞壁多糖的開發(fā)尚未見報道.酵母細(xì)胞壁多糖具有提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、吸附毒素、抗輻射、抗氧化和降血脂等生理功能，是開發(fā)功能食品、保健品的重要原料[5-7].采用全細(xì)胞制備酵母多糖的傳統(tǒng)方法，不僅酸堿用量大、污染環(huán)境，而且會引起多糖降解，影響其生理活性[8].因此，利用誘導(dǎo)劑激活處于胞內(nèi)鈍化狀態(tài)的自溶酶，降解、去除細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，以細(xì)胞壁作為原料提取多糖是獲得高純度產(chǎn)品的有效途徑[9-11].酵母自溶后細(xì)胞內(nèi)離子及氨基酸溶出細(xì)胞，且隨著自溶程度增強(qiáng)，上清液的電導(dǎo)率和氨基氮含量也隨之提高，是評價酵母自溶效果的可靠指標(biāo)[12-13].本試驗以葡萄酒酒泥酵母為原料，選擇安全、廉價的NaCl為誘導(dǎo)劑，以自溶前后電導(dǎo)率及氨基氮含量的變化為評價指標(biāo)，優(yōu)化建立了葡萄酒泥酵母自溶工藝條件，以期為分離提取高品質(zhì)酵母多糖提供技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒酵母泥由甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司提供；醋酸、醋酸鈉、甲醛、麝香草酚酞、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純.

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；TDZ5-WS湘儀離心機(jī)；SL-1001電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C pH計(上海雷磁有限公司)；DDS-11A電導(dǎo)儀(杭州奧利龍儀器有限公司).

1.2試驗方法

1.2.1操作步驟葡萄酒泥→預(yù)處理→收集濕酵母→加入緩沖液→誘導(dǎo)自溶→加熱滅酶→離心分離→上清液→測定上清液電導(dǎo)率及氨基氮含量

1.2.2操作要點

1.2.2.1葡萄酒泥的預(yù)處理收集葡萄酒酒泥，與蒸餾水以1∶1混合，用80目篩篩分，4 000 r/min離心15 min.重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集濕酵母備用[14].

1.2.2.2自溶前處理取3.0 g濕酵母于50 mL具塞離心管中，量取30 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液懸浮菌體，攪拌均勻，4 000 r/min離心15 min[15].取上清液，測定自溶前上清液電導(dǎo)率及氨基氮含量.

1.2.2.3自溶于離心管中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl、以及不同的溫度、pH和時間處理，誘導(dǎo)酵母自溶.自溶后85 ℃水浴滅酶15 min，4 000 r/min離心15 min.

1.2.3單因素試驗設(shè)計參照文獻(xiàn)[3,15]方法，選擇影響酵母自溶的主要影響因素，以自溶前后電導(dǎo)率及氨基氮含量變化值為依據(jù)，各因素水平設(shè)置如下：NaCl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4%，溫度為42.5、45.0、47.5、50.0、52.5 ℃，緩沖液pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，自溶時間24、27、30、33、36 h.

1.2.4正交試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定酵母自溶的正交試驗因素和水平，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，優(yōu)化酵母自溶的最優(yōu)工藝，重復(fù)3次.

1.2.5測定方法

1.2.5.1電導(dǎo)率測定參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行.

1.2.5.2氨基氮含量測定甲醛滴定法[16]，具體計算方法如下：

式中：V末為滴定待測液耗用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)；V對為滴定對照液耗用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)；MNaOH為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的摩爾濃度.

1.2.6Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量計算

Δ電導(dǎo)率=自溶后上清液電導(dǎo)率-自溶前上清液電導(dǎo)率；

Δ氨基氮含量=自溶后上清液氨基氮含量-自溶前上清液氨基氮含量.

2結(jié)果與分析

2.1單因素結(jié)果與分析

2.1.1NaCl添加量對酵母自溶效果的影響由圖1可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，Δ電導(dǎo)率為1.51 ms/cm，Δ氨基氮含量為1.610 92 mg/mL，自溶效果好，所以選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的NaCl為酵母自溶的較佳添加量.這主要是由于NaCl有利于酵母的質(zhì)壁分離，從而促進(jìn)酵母內(nèi)自溶酶類與蛋白質(zhì)等底物的充分接觸.當(dāng)NaCl添加量小于3%時，適量的鹽濃度對酶類具有促進(jìn)作用，能夠較明顯地促進(jìn)酶促反應(yīng)；當(dāng)NaCl添加量大于3%時，酵母質(zhì)壁已分離完全，促進(jìn)作用沒有明顯差異，同時較大的鹽濃度會對酶作用的發(fā)揮具有一定的抑制作用.

圖1　NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對自溶效果的影響

2.1.2溫度對酵母自溶效果的影響由圖2可知，處理溫度不同，電導(dǎo)率和氨基氮含量的變化不同.當(dāng)溫度為47.5 ℃時，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量值最大，自溶效果最明顯，所以選擇47.5 ℃為葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶的較佳處理溫度.當(dāng)溫度小于47.5 ℃時，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量隨溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，說明在此溫度范圍內(nèi)，酵母細(xì)胞內(nèi)酶類的活性隨著溫度的升高逐漸增大；溫度高于47.5 ℃時，隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)自溶酶失活，從而影響自溶效果.

圖2　溫度對自溶效果的影響

2.1.3pH對酵母自溶效果的影響由圖3可知，緩沖液的pH不同時，酵母自溶效果存在差異.當(dāng)pH 5.0時，自溶效果最好，所以選擇pH 5.0為葡萄酒泥酵母誘導(dǎo)自溶的較佳pH.究其原因，當(dāng)pH值為5.0時，達(dá)到了酵母細(xì)胞內(nèi)自溶酶的適宜pH值，自溶酶充分水解底物；當(dāng)pH偏離5.0時，酶活性均降低，影響自溶效果.

圖3　pH對自溶效果的影響

2.1.4時間對酵母自溶效果的影響由圖4可知，自溶時間為30 h時，自溶效果最好，所以選擇30 h為酵母誘導(dǎo)自溶的較佳時間.誘導(dǎo)自溶小于30 h時，有足夠含量的底物與蛋白水解酶充分反應(yīng)，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量呈上升趨勢.自溶大于30 h后，酵母中的可溶性物質(zhì)幾乎全部釋放，自溶液出現(xiàn)氮味和苦味，不具有實際應(yīng)用價值，Δ電導(dǎo)率和Δ氨基氮含量的降低，可能是酵母細(xì)胞中一些酶，進(jìn)一步將水解得到的氨基酸分解了，導(dǎo)致氨基態(tài)氮得率下降.

圖4　間對自溶效果的影響

2.2正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以自溶前后上清液的電導(dǎo)率及氨基氮含量的變化量為考察指標(biāo)，進(jìn)行了L9(34)正交試驗，試驗結(jié)果見表1.對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過直觀分析和極差分析得到最優(yōu)組合，在最優(yōu)組合的試驗條件下酵母自溶效果和其他試驗組合對照進(jìn)行驗證試驗，確定酵母自溶的最優(yōu)工藝.

由表1的數(shù)據(jù)結(jié)果可得出影響電導(dǎo)率變化因素的主次順序為：C>B>D>A，由K值可以確定其正交試驗的最優(yōu)組合為A2B1C1D3；影響氨基氮含量變化因素的主次順序為：B>C>A>D，由K*值可以確定其正交試驗的最優(yōu)組合為A2B1C1D3.經(jīng)綜合平衡法分析得出影響酵母自溶效果的正交試驗的最優(yōu)組合是A2B1C1D3，即溫度為47.5℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH為4.5，處理時間為33 h.

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表2.由表2可知，因素B和C在P<0.05的水平上有顯著性差異，因素A和D不顯著.

2.3驗證試驗結(jié)果

由于正交試驗得到的最優(yōu)組合在L9(34)正交試驗設(shè)計中未出現(xiàn)，所以需對正交試驗得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗證試驗.在溫度為47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH為4.5，處理時間為33 h的條件下進(jìn)行試驗，驗證酵母自溶效果，重復(fù)3次.測得電導(dǎo)率變化量為2.49 ms/cm，氨基氮含量變化量為2.154 90 mg/mL，比正交試驗中最優(yōu)組合的自溶效果好.可見，經(jīng)正交試驗所確定的是最佳工藝參數(shù).

表1　L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表2　正交試驗方差分析結(jié)果

*：差異顯著(P<0.05).

3結(jié)論

本試驗確定的葡萄酒泥酵母細(xì)胞自溶的最優(yōu)工藝參數(shù)為溫度47.5 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH 4.5，處理時間33 h，在此條件下所得酵母抽提液自溶前后電導(dǎo)率增加2.49 ms/cm，氨基氮含量增加2.154 90 mg/mL，自溶效果最好.

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-06-11；修回日期：2014-07-01

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2013-21)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計劃重點項目(20140831) .

通信作者：楊學(xué)山，男，副教授，研究方向為生物化學(xué)與生物產(chǎn)品研發(fā).E-mail:yangxs@gsau.edu.cn

中圖分類號：TS 261.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0155-05