響應(yīng)面優(yōu)化西蘭花中蘿卜硫素的超聲輔助提取工藝

唐斌，馬紹英 ，李勝，趙生琴，張品南，曹寶臣，

趙學(xué)榮1 ，康繼紅1，周文政2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070； 2.蘭州匯通生物科技有限公司，甘肅 蘭州　730020；

3.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅 張掖　743000)

響應(yīng)面優(yōu)化西蘭花中蘿卜硫素的超聲輔助提取工藝

唐斌1，馬紹英1，李勝1，趙生琴1，張品南1，曹寶臣1，

趙學(xué)榮1，康繼紅1，周文政2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070； 2.蘭州匯通生物科技有限公司，甘肅 蘭州730020；

3.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅 張掖743000)

摘要：對(duì)超聲輔助提取西蘭花中蘿卜硫素的工藝進(jìn)行了研究，以西蘭花鮮食部分綠色幼嫩花莖和花蕾為試驗(yàn)材料，利用單因素及響應(yīng)面法對(duì)外源芥子酶酶解西蘭花后，超聲波輔助乙醇提取蘿卜硫素的工藝參數(shù)進(jìn)行篩選及優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取酶解時(shí)間，料液比和提取時(shí)間3個(gè)因素，再根據(jù)Central Composite中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定各因素對(duì)蘿卜硫素提取率的影響程度.結(jié)果表明：超聲輔提取西蘭花中蘿卜硫素的最佳提取條件為：酶解時(shí)間0.95 h，料液比1∶41.8，提取時(shí)間1.1 h，理論提取率為1 890.81 μg/g，驗(yàn)證提取率為1 814.59 μg/g，其相對(duì)誤差為4.20%，表明該提取工藝參數(shù)在西蘭花中提取蘿卜硫素是可行的.

關(guān)鍵詞：西蘭花；超聲波輔助提??；蘿卜硫素；單因素；響應(yīng)面

第一作者：唐斌(1989-)，男，碩士研究生，從事植物細(xì)胞工程及活性成分提取研究.E-mail：814482932@qq.com

Optimization on extraction techniques of sulforaphane from

broccoli with ultrasound-assisted by response

surface methodology

TANG Bin1,MA Shao-ying1,LI Sheng1,ZHAO Sheng-qin1,ZHANG Pin-nan1,CAO Bao-chen1,

ZHAO Xue-rong1,KANG Ji-hong1,ZHOU Wen-zheng2,3

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Lanzhou Huitong Bio-

Technology Co.Ltd.,Lanzhou 730070,China;3.Gansu Shunyi Bio-Technology Co.Ltd.，Zhangye 734000,China)

Abstract：Fresh parts of broccoli were chosen as experimental material,and extraction techniques were optimized on sulforaphane from broccoli with the ultrasound-assisted.The process parameters of extracted by ethanol with assistance of ultrasonic wave were screened and optimized though the method of single factor and response surface after exogenous myrosinase hydrolyze the fresh part.Enzymolysis time,solid-liquid ratio and extraction time were screened on the basis of single factor experiment,the effects of various factors on extraction ratio were determined by the method of response surface analysis with three factors and three levels according to the central composite design method of Central Composite.The optimum extraction conditions were as enzymolysis time 0.95 h,solid-liquid ratio 1∶41.8,extraction time 1.1 h.The theoretical extraction rate reached 1 890.81 μg/g and the verification extraction rate was 1 814.59 μg/g,and the relative error was 4.20%.The results showed that these parameters were practicable to extract sulforaphane from broccoli.

Key words：ultrasound-assisted broccoli;extraction;sulforaphane;single factor;response surface

蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強(qiáng)的天然活性成分之一[1-3]，其抗癌作用已在大鼠的乳腺癌防治中得到充分的證明[4-5].西蘭花中含有豐富的硫代葡萄糖苷，它是十字花科植物中重要的次生代謝物，在內(nèi)源芥子酶作用下可水解生成蘿卜硫素[4].目前，蘿卜硫素的提取研究主要是從西蘭花種子中提取[6-7]，但由于種子價(jià)格高達(dá)4 000元/kg，且含量相對(duì)較低[8]，提取成本高，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；也有從離體細(xì)胞中提取蘿卜硫素的研究[9-10]，但西蘭花離體細(xì)胞含水率高，且大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)成本高，不利于規(guī)?；a(chǎn).從西蘭花中提取蘿卜硫素的研究已有報(bào)道，但提取率較低，也未能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn).本試驗(yàn)擬通過(guò)添加外源芥子酶，以提高西蘭花中蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率[4]，再借助超聲波輔助有機(jī)提取法，提高提取效率[11-12]，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝[13-14]，以期為西蘭花中蘿卜硫素的規(guī)?；崛√峁┘夹g(shù)參考和理論依據(jù).

1材料及方法

1.1材料與試劑

新鮮西蘭花‘中青2號(hào)’，購(gòu)于蘭州市蔬菜市場(chǎng)；蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，含量>98%；95%的乙醇(食品級(jí))，乙酸乙酯(分析純)，甲醇(色譜純).

1.2儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；超聲波振蕩儀，上海生析超聲儀器有限公司；島津高效液相色譜儀系統(tǒng)(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和島津Lcsolution 15c色譜工作站)，日本島津公司.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蘿卜硫素提取工藝取80 ℃下脫水1 h、后在60 ℃下脫水至恒質(zhì)量的西蘭花，粉碎，過(guò)60目篩，稱取10 g置于三角瓶中待用，另取新收獲芥籽，粉碎，過(guò)60目篩，稱取1g至三角瓶中，加50 mL蒸餾水，超聲波振蕩20 min，過(guò)濾除雜得酶液，向西蘭花干粉中加入酶液50 mL，室溫(25 ℃)下酶解1 h，冷凍干燥后加入95%乙醇400 mL超聲波提取0.5 h，靜置0.5 h，過(guò)濾，65 ℃旋蒸濃縮，按體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，60 ℃旋蒸濃縮，最后用甲醇定容至25 mL，待測(cè).

1.3.2蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋成濃度為100、75、50、25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.進(jìn)行HPLC色譜分析，以測(cè)定的蘿卜硫素峰面積為橫坐標(biāo)(x)，蘿卜硫素濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：

y=0.000 03x-0.510 4，R2=0.999 9

1.3.3蘿卜硫素的HPLC分析取甲醇定容后的樣液1 mL，稀釋10倍，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析；色譜條件為：色譜柱：TP5-3260(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=65∶35；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：201 nm；進(jìn)樣量：20 μL.

1.3.4蘿卜硫素含量計(jì)算公式蘿卜硫素含量用式(1)計(jì)算：

(1)

式中：蘿卜硫素含量單位為μg/g，蘿卜硫素濃度單位為μg/mL，定容體積單位為mL，原料質(zhì)量單位為g.

1.3.5單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照1.3.1所述方法提取蘿卜硫素，研究不同材料碎度(20、40、60目)、酶液量(1∶0、1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4)、酶解時(shí)間(0、1、2、4、6、8、10 h)、提取次數(shù)(1、2、3)、料液比(1∶20、1∶40、1∶60)、提取時(shí)間(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、乙醇濃度(75%、85%、95%、100%)對(duì)蘿卜硫素提取率的影響，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)過(guò)程中，除考查的因素外，其他因素的試驗(yàn)水平為材料碎度(40目)、酶液量(1∶0.2)、酶解時(shí)間2 h、提取次數(shù)1次、料液比(1∶40)、提取時(shí)間0.5 h、乙醇濃度95%.在單因素方差分析中，通過(guò)F檢驗(yàn)來(lái)判斷單因子對(duì)蘿卜硫素提取率的影響是否顯著.

1.3.6響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Central Composite中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，選取3個(gè)影響最顯著的因素為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn).

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1材料碎度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響通過(guò)選擇粉碎程度不同的材料，考察材料碎度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.材料碎度影響外源芥子酶進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞中蘿卜硫素的釋放.由圖1可以看出，隨材料粉碎目數(shù)增大，蘿卜硫素提取率明顯增大，可能是因?yàn)椴牧戏鬯槌潭仍礁?，外源芥子酶越容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有利于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生化反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)超聲波輔助提取時(shí)細(xì)胞更易破碎，有利于蘿卜硫素的提取.考慮到將材料粉碎至60目會(huì)增加工作量，降低工作效率，故選擇40目為最佳條件.

圖1　材料碎度對(duì)提取率的影響

2.1.2外源芥子酶液添加量對(duì)蘿卜硫素提取率的影響通過(guò)向相同質(zhì)量西蘭花粉末中加入不同體積的芥子酶液，考察西蘭花粉末質(zhì)量與芥子酶液量的比例對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.外源芥子酶的量影響細(xì)胞中硫代葡萄糖苷的水解，通過(guò)添加外源芥子酶，促進(jìn)細(xì)胞中的硫代葡萄糖苷被水解為蘿卜硫苷，蘿卜硫苷進(jìn)一步降解成蘿卜硫素，從而提高細(xì)胞中蘿卜硫素含量.由圖2可以看出，而相同質(zhì)量的干樣，隨加入的酶液量的增加，蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化和提取效率升高，而超過(guò)1∶2.5的酶料體積比時(shí)，提取與轉(zhuǎn)化效率下降.當(dāng)選擇西蘭花粉末∶酶液=1∶2.5時(shí)，雖提取率最高，但酶液體積相對(duì)太小，難以混合均勻，故選擇1∶5為最佳條件.

圖2　酶量對(duì)提取率的影響

2.1.3酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素提取率的影響通過(guò)設(shè)置不同的酶解時(shí)間梯度，考察酶解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.酶解時(shí)間影響細(xì)胞中硫代葡萄糖苷能否完全水解成蘿卜硫苷.從圖3可以看出酶解0 h到1 h蘿卜硫素提取率顯著增加，酶解時(shí)間超過(guò)1 h后，提取率明顯下降.可能是因?yàn)槊附? h可以使細(xì)胞中的硫代葡萄糖苷充分降解，最后生成蘿卜硫素，當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，由于蘿卜硫素的穩(wěn)定性較差[16]，積累的蘿卜硫素會(huì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，導(dǎo)致提取率下降，所以，選擇酶解時(shí)間1 h為最佳條件.

圖3　酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.4提取次數(shù)對(duì)蘿卜硫素提取率的影響對(duì)材料進(jìn)行不同次數(shù)的提取，合并提取液，考察提取次數(shù)對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.提取次數(shù)影響細(xì)胞中蘿卜硫素是否提取完全.從圖4可以看出，提取2次較1次提取率有所提高，但增加不顯著，因而選擇提取1次為最佳提取次數(shù).

2.1.5料液比對(duì)蘿卜硫素提取率的影響通過(guò)對(duì)相同質(zhì)量的西蘭花干粉中加入不同體積的95%的乙醇，考察料液比對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.從圖5看出，料液比從1∶20增到1∶40時(shí)，提取率顯著增加，由1∶40繼續(xù)增大時(shí)，提取率略有下降.當(dāng)提取溶劑體積增大時(shí)，增大了材料與提取劑的接觸面積，提取更加充分，但增加了后續(xù)步驟的時(shí)間，導(dǎo)致蘿卜硫素部分分解，所以選擇料液比為1∶40為最佳條件.

圖4　提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

圖5　料液比對(duì)提取率的影響

2.1.6提取時(shí)間對(duì)提取率的影響通過(guò)設(shè)置不同的提取時(shí)間梯度，考察提取時(shí)間對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.從圖6可以看出，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，蘿卜硫素提取率逐漸增大，1 h時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間繼續(xù)增加，提取率有所下降.提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，能耗增加，部分蘿卜硫素發(fā)生分解.所以，選擇1 h為最佳條件.

圖6　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.7乙醇濃度對(duì)提取率的影響通過(guò)選用不同濃度的乙醇作為提取劑，考察乙醇濃度對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.從圖7可以看出，體積分?jǐn)?shù)75%至100%的乙醇對(duì)提取率影響不顯著，考慮到乙醇濃度太小，濃縮難度加大，若用99%的高純乙醇，成本增加，故選擇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇為最佳條件.

圖7　乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解時(shí)間，料液比，提取時(shí)間3個(gè)主要因素為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平RSM表，試驗(yàn)因素與水平如表1所示.為數(shù)據(jù)處理的方便，對(duì)表2所列的酶解時(shí)間、料液比、和提取時(shí)間的實(shí)際值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化變換，變換公式如下：酶解時(shí)間A=(A*-1)/0.5，料液比B=(B*-40)/20，提取時(shí)間C=(C*-1)/0.5，其中A*、B*、C*均為實(shí)際水平，A、B、C為參與分析的邏輯水平.以3次試驗(yàn)所得蘿卜硫素提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素水平

采用Design-Expert 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程，方程可靠性由R2表示，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn)，影響因素線性效應(yīng)，平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P值檢驗(yàn).

2.2.2蘿卜硫素提取率預(yù)測(cè)模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)各處理組合的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后得到二階響應(yīng)表面模型方程：

y=1 885.53-62.50A+45.35B+14.29C+40.39AB+95.14AC+75.71BC-278.81A2-250.22B2-271.53C2

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表4　提取率回歸分析結(jié)果

2.2.3各因素的交互作用根據(jù)圖8～10中響應(yīng)面及圖中的等值線的形狀分析酶解時(shí)間、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)蘿卜硫素提取率的影響.等值線的形狀反映交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示2個(gè)因素之間的交互作用較強(qiáng)，圓形則兩因素之間的交互作用較弱.由圖8～10看出，AB、AC、BC之間交互作用均不顯著.

3討論與結(jié)論

有研究認(rèn)為酶解條件對(duì)蘿卜硫素的提取是影響最顯著的因素，因此只考察酶解條件[4,18-19]的影響，本試驗(yàn)研究表明材料碎度，外源芥子酶液添加量，酶解時(shí)間，料液比，提取時(shí)間均對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取率有顯著性影響.說(shuō)明在研究蘿卜硫素的提取工藝時(shí)，應(yīng)充分考慮可能的影響因素.

圖8　Y=f(A,B)的響應(yīng)面

圖9　Y=f(A,C)的響應(yīng)面

圖10　Y=f(B,C)的響應(yīng)面

試驗(yàn)中，添加外源芥子酶的量增加時(shí)，提取率顯著提高，繼續(xù)增加時(shí)，提取率穩(wěn)定在較高水平，說(shuō)明催化效果達(dá)到最佳，進(jìn)一步增加酶量，提取率反而下降，可能原因是，粗酶液的用量達(dá)到一定量時(shí)，酶解理化環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致蘿卜硫苷降解生成的蘿卜硫素與蘿卜硫腈比例發(fā)生變化，反應(yīng)生成的蘿卜硫素量減少，具體原因還有待進(jìn)一步研究.

本試驗(yàn)通過(guò)添加外源芥子酶，促進(jìn)細(xì)胞中的硫代葡萄糖苷向蘿卜硫苷轉(zhuǎn)化，蘿卜硫苷進(jìn)一步降解成蘿卜硫素，從而提高細(xì)胞中蘿卜硫素含量，這與王見(jiàn)冬等[4]、季宇彬等[19]的結(jié)論一致.但外源芥子酶的種類，酶液制備方法，酶液濃度，酶解條件等因素與超聲波處理參數(shù)更進(jìn)一步復(fù)合的具體量化試驗(yàn)研究有待開(kāi)展.

在從植物中提取有效成分的研究中，多采取微波和超聲波輔助以提高效率，但微波輔助提取易產(chǎn)生高溫，不適用于穩(wěn)定性較差的蘿卜硫素提取.本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取，大大提高了提取效率，但是如何將超聲波輔助與酶解提取結(jié)合起來(lái)，進(jìn)一步縮短提取周期還有待研究.

本試驗(yàn)得到的理論提取率為1 890.81 μg/g，與謝述瓊等人[20]在青花椰菜于90 ℃烘干條件下蘿卜硫素的提取率480.0 μg/g有大幅提高，可能原因是所選材料，烘干條件不同，更重要的原因是提取過(guò)程中是否添加外源芥子酶以及酶活性強(qiáng)弱.

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了西蘭花中蘿卜硫素的最佳提取參數(shù)為酶解時(shí)間0.95 h，料液比1∶41.8，提取時(shí)間1.1 h，按照此工藝條件可以使西蘭花中蘿卜硫素的提取率達(dá)到1 890.81 μg/g.

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-20；修回日期：2014-05-15

基金項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)新教師基金項(xiàng)目(20096202120008)；全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201210733009)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(20140825、20140824)；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-1-183).

通信作者：馬紹英，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞工程，植物活性成分的提取與開(kāi)發(fā).E-mail：mashy@gsau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S 635.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2015)02-0171-07