結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性胸膜炎的應(yīng)用價(jià)值

石　慧　崔麗英

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性胸膜炎的應(yīng)用價(jià)值

石慧1崔麗英2

結(jié)核性胸膜炎是胸膜對(duì)結(jié)核菌高度變態(tài)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的胸膜炎癥，為最常見(jiàn)的胸膜疾病之一，在各種不同病因的胸腔積液中占30%～60%。在我國(guó)約占滲出性胸腔積液的54.8%，與淋巴結(jié)結(jié)核并列為最常見(jiàn)的2種肺外結(jié)核病[1-2]。其發(fā)病率與結(jié)核病疫情相關(guān)，我國(guó)是結(jié)核病高疫情國(guó)家，結(jié)核性胸膜炎患病率較高。隨著社會(huì)人口的老齡化，患者年齡有進(jìn)行性增長(zhǎng)趨勢(shì)，并增加了結(jié)核性胸膜炎診斷的難度與復(fù)雜性。一般診斷需依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)、胸液的化驗(yàn)等綜合判斷，必要時(shí)行胸膜活檢及胸腔鏡等有創(chuàng)性檢查。傳統(tǒng)檢查手段敏感性和特異性均較差，胸液抗酸桿菌檢出率極低，培養(yǎng)陽(yáng)性率低且耗時(shí)較長(zhǎng)，影響治療。診斷金標(biāo)準(zhǔn)的胸膜活檢為有創(chuàng)性檢查，陽(yáng)性率僅62.2%～69.7%[3-4]，不適合常規(guī)采用。故臨床上渴望將新的快速、有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)引入并應(yīng)用到結(jié)核性胸膜炎的診斷中。近年來(lái)，一種新的免疫酶技術(shù)-酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)，正被用于診斷結(jié)核感染，已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的認(rèn)可。它是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體的細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞[5]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(tuberculous infection of Tcells spot test, T-SPOT.TB)由ELISPOT發(fā)展而來(lái)，它是使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(ESAT-6和CFP-10)作為刺激源，刺激機(jī)體分泌細(xì)胞因子-γ干擾素(INF-γ)，然后檢測(cè)機(jī)體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放γ干擾素的特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而判斷結(jié)核感染狀態(tài)，本研究旨在探討該技術(shù)方法在診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性和特異性[6]。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

選取2012年2月至20 13年2月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科收治的胸腔積液住院患者60例。常規(guī)進(jìn)行胸水常規(guī)、生化、細(xì)胞病理學(xué)、癌胚抗原等檢查，排除漏出液后均行外周血及胸水T-SPOT.TB檢測(cè)，按最終臨床診斷結(jié)果進(jìn)行分組：結(jié)核性胸膜炎組和非結(jié)性胸膜炎組，對(duì)診斷結(jié)核性胸膜炎組患者規(guī)律抗結(jié)核3個(gè)月后隨診，再次行血T-SPOT.TB檢測(cè)。

二、分組方法

1. 結(jié)核性胸膜炎組診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有低熱、盜汗、消瘦、乏力等結(jié)核中毒癥狀；②超聲提示有胸腔積液，肺CT伴有或不伴有結(jié)核病灶；③胸水以單型核細(xì)胞為主的滲出液；胸水ADA≥45 U/L[7]；④胸水查癌細(xì)胞陰性，癌胚抗原正常；⑤抗結(jié)核治療胸水吸收明顯，癥狀好轉(zhuǎn)；⑥胸膜活檢有典型結(jié)核病變(如結(jié)核性肉芽腫或干酪樣病變)或痰分枝桿菌涂片陽(yáng)性；符合①～⑤或⑥[8-9]，并且抗結(jié)核治療少于2周。

2.非結(jié)核性胸膜炎組：排除結(jié)核性胸膜炎的滲出性胸膜炎者。所有患者行HIV檢測(cè)為陰性，排除血性胸水，送檢胸水均為新鮮活體胸水。

三、試驗(yàn)方法

1. 試劑：T-SPOT.TB試劑盒(英國(guó)Oxford immunotec公司)、ESAT-6多肽(抗原A)、CFP-10多肽(抗原B)、植物血凝素、底物顯色劑、 細(xì)胞培養(yǎng)液、人外周血淋巴細(xì)胞分離液、培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀 (德國(guó)AID公司)等。

2. 試驗(yàn)步驟：① 分離外周血淋巴細(xì)胞；② 制備胸水單個(gè)核細(xì)胞； ③ ELISPOT檢測(cè) ；④ 觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀。

3. 實(shí)驗(yàn)有效的判定：空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)小于10且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)大于20。陽(yáng)性結(jié)果的判定：①檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)減去對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；②空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)必須>2倍的空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。最終斑點(diǎn)數(shù)判讀：檢測(cè)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)，然后乘以4，每1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)活化的特異性T淋巴細(xì)胞，結(jié)果計(jì)作SFC(spot forming cell，斑點(diǎn)形成細(xì)胞)/106。此實(shí)驗(yàn)為兩種抗原的并聯(lián)試驗(yàn)，其中一項(xiàng)陽(yáng)性則結(jié)果判定為陽(yáng)性。陽(yáng)性閾值是任一抗原刺激后結(jié)果≥24 SFC/106。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布采用成組t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布采用配對(duì)符號(hào)秩檢驗(yàn)，兩組率間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、受試者基本情況

入選60例患者按最終診斷分為結(jié)核性胸膜炎組36例(男性20例，女性16例，年齡16～86歲，平均55.17歲)，其中單純性胸膜炎25例(69.4%)，合并活動(dòng)性肺結(jié)核9例(25%)，多發(fā)性漿膜炎2例(5.6%)，合并SLE 1例(2.8%)，合并高血壓1例(2.8%)，合并冠心病1例(2.8%) ，合并糖尿病1例(2.8%)，有外周血T-SPOT.TB復(fù)診結(jié)果的14例(39%)。非結(jié)性胸膜炎24例(男性13例，女性11例，年齡30～89歲，平均65.25歲)，其中確診惡性腫瘤16例(66.7%)，其它診斷8例(33.3%)，分別是：肺炎旁胸腔積液3例(12.5%)，肺淀粉樣變1例(4.2%)，成人Still病1例(4.2%)，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化1例(4.2%)，SLE 1例(4.2%)，乳糜樣胸水1例(4.2%)。

二、T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果

兩組患者外周血及胸水中T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表1，2。外周血T-SPOT.TB檢測(cè)敏感性為88.9%，特異性為83.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.9%，陰性預(yù)測(cè)值為83.3%。胸水T-SPOT.TB檢測(cè)敏感性為100%，特異性為70.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.7%，陰性預(yù)測(cè)值為100%。

表1　兩組患者血中T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果

表2　兩組患者胸水中T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果

三、結(jié)核性胸膜炎組外周血與胸水中不同抗原刺激后SFC數(shù)量比較

以抗原ESAT-6、抗原CFP-10作為刺激源，胸水中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)分別是(1374.25±770.45)SFC/106、(1606.36±836.06)SFC/106，外周血中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)分別是(358.56±407.98)SFC/106、(279.28±327.48)SFC/106，二者采用配對(duì)符號(hào)秩檢驗(yàn)，胸水與外周血比較存在顯著性差異(P<0.001)，見(jiàn)表3。兩組患者中外周血與胸水不同抗原T-SPOT.TB形成的SFC數(shù)量比較，見(jiàn)圖1。

表3　結(jié)核性胸膜炎組外周血與胸水中不同抗原

注：本實(shí)驗(yàn)中SFC數(shù)量均為偏態(tài)分布，出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)差大于均值，故采用Wilcoxin 符號(hào)秩檢驗(yàn)

圖1　兩組患者外周血與胸水中不同抗原T-SPOT.TB

討論

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，肺外結(jié)核常因病情隱匿或表現(xiàn)不典型，極容易誤診漏診，影響預(yù)后。過(guò)去常用TST進(jìn)行篩查，但因敏感性及特異性太低被臨床淘汰。做病理學(xué)檢查常為有創(chuàng)性臨床不易實(shí)施，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低并耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，延誤治療。近年來(lái)，T-SPOT.TB作為一種新的診斷結(jié)核感染的免疫學(xué)方法被大家關(guān)注，多項(xiàng)研究表明它有較好的敏感性和特異性，不受卡介苗接種影響[10-12]。

Wilkinson等[13]于2005年最先在英國(guó)進(jìn)行了胸水中單個(gè)核細(xì)胞ESAT-6-ELISPOT 檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的研究，選擇10例結(jié)核性胸膜炎，8例癌性胸腔積液患者，結(jié)果證實(shí)了胸水單個(gè)核細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎可行性。胸水ELISPOT檢測(cè)到的釋放γ干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)量是外周血中的(15±6)倍，而癌性胸腔積液T細(xì)胞數(shù)量缺乏或極低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異。后有文獻(xiàn)報(bào)道在對(duì)歐洲及臺(tái)灣的胸腔積液患者小樣本研究中，得出胸水及外周血的T-SPOT.TB檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎均有較好的敏感性、特異性，胸水的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為外周血陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的4～10倍[14-15]。

我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家，本研究在結(jié)核高發(fā)地區(qū)對(duì)TB患者胸腔積液中的外周血及胸水同時(shí)進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)，結(jié)果表明外周血診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性是88.9%，陰性預(yù)測(cè)值為83.3%；而外周血診斷結(jié)核性胸膜炎的特異性是83.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.9%，與Losi等[14]的結(jié)果相似。低于劉珍瓊等[16]所報(bào)告的胸腔積液T-SPOT.TB試驗(yàn)敏感性93.7%、特異性96.1%；外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)敏感性81.2% 、特異性92.3%的結(jié)果。

在本研究中得出胸水T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性為100%，陰性預(yù)測(cè)值是100%，高于外周血88.9%的敏感性，胸水中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)平均是外周血的9.2倍，與國(guó)外報(bào)道的結(jié)果一致[13-15]。出現(xiàn)外周血低于胸水的原因可能是因?yàn)榛罨牧馨图?xì)胞向胸膜腔遷移，效應(yīng)T細(xì)胞更多的移向病變部位，從而外周血中效應(yīng)T細(xì)胞減少[15]。這個(gè)結(jié)果提示我們對(duì)于考慮診斷不明的胸腔積液患者，如果是滲出液，可首選進(jìn)行胸水T-SPOT.TB檢測(cè)，如果陰性，有利于排除結(jié)核性胸膜炎的診斷，縮小診斷范圍。

有研究提示，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞存活期很短，一般在病原體被消滅后就消失，所以監(jiān)測(cè)外周血T-SPOT.TB結(jié)果可用來(lái)評(píng)估療效及監(jiān)測(cè)病情活動(dòng)性[17-18]。本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)對(duì)36例結(jié)核性胸膜炎患者進(jìn)行了隨訪，但因?yàn)橹T多原因，僅14例在規(guī)律抗結(jié)核3月后完成了外周血T-SPOT.TB檢測(cè)(14/36)，其中10例患者結(jié)果陰性，4例仍呈陽(yáng)性，但斑點(diǎn)數(shù)出現(xiàn)明顯下降，這與國(guó)外研究結(jié)論相符[19]，即活動(dòng)性結(jié)核在經(jīng)過(guò)有效的抗結(jié)核治療后，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析未完全轉(zhuǎn)陰的4例患者，2例為合并肺結(jié)核，2例是胸水吸收較慢并形成包裹性積液，提示T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果與臨床療效是一致的，可作為結(jié)核病的療效評(píng)估手段[20]。本實(shí)驗(yàn)因例數(shù)較少，希望有更多的研究進(jìn)一步支持。

ELISPOT較傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法有更好的穩(wěn)定性，但本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，仍受一些外在因素干擾，如實(shí)驗(yàn)人員的操作手法等。其次，我們發(fā)現(xiàn)，在較低溫度環(huán)境中效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量會(huì)有所減少。胸水放置時(shí)間較長(zhǎng)后，T淋巴細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸減少至消失，所以必須采集新鮮胸水送檢。該實(shí)驗(yàn)操作步驟相對(duì)較多，試劑成本較高，期望有國(guó)內(nèi)的試劑代替，便于臨床更好的推廣及應(yīng)用。

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(本文編輯：王亞南)

石慧，崔麗英. 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性胸膜炎的應(yīng)用價(jià)值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 195-199.

·論著·

【摘要】目的探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)在診斷結(jié)核性胸膜炎中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取2012年2月至2013年2月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科收治的胸腔積液住院患者60例，排除漏出液后均行血、胸水T-SPOT.TB檢測(cè)，按最終臨床診斷再分為結(jié)核性胸膜炎組和非結(jié)核性胸膜炎組。對(duì)結(jié)核性胸膜炎組患者規(guī)律抗結(jié)核3個(gè)月后隨診，再次行血T-SPOT.TB檢測(cè)，以敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值為評(píng)價(jià)目標(biāo)，探討T-SPOT.TB在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果臨床診斷為結(jié)核性胸腔積液患者36例，外周血T-SPOT.TB 檢測(cè)陽(yáng)性32例，胸水T-SPOT.TB 檢測(cè)陽(yáng)性36例，敏感性分別為88.9%、100.0%。24例非結(jié)核性胸腔積液患者中，外周血T-SPOT.TB 檢測(cè)陽(yáng)性4例，胸水T-SPOT.TB 檢測(cè)陽(yáng)性7例，特異性分別為88.9%、70.8%。外周血與胸水T-SPOT.TB 檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別是88.9%、83.3%、83.7%、100.0%。胸水T-SPOT.TB 檢測(cè)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)平均是外周血的4～6倍，抗結(jié)核治療后外周血斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)明顯下降或缺失。結(jié)論外周血及胸水T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)診斷結(jié)核性胸膜炎特異性及敏感性均較高，可以作為診斷結(jié)核性胸膜炎的一種快速、有效方法；胸水T-SPOT.TB 檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值優(yōu)于外周血T-SPOT.TB 檢測(cè)；治療前后血T-SPOT.TB檢測(cè)可作為結(jié)核病情療效評(píng)估。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；結(jié)核性胸膜炎；診斷

T-SPOT.TB clinical value in the diagnosis of tuberculous pleurisyShihui,Cuiliying.DepartmentofRespiration,InnerMongoliainternationalMongolianhospital,Hohhot010065,China;Respiratorymedicine,InnerMongoliamedicaluniversityaffiliatedhospital,Hohhot010050,China

Correspondingauthor：Cuiliying,Email:Lijiming931@sohu.com

【Abstract】ObjectiveTo research the tuberculous infection of Tcells spot test(T-SPOT.TB) clinical value in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Methods60 cases of hospitalized patients with pleural effusion were enrolled between February 2012 to February 2013 in Inner Mongolia medical university affiliated hospital of respiratory medicine, eliminate leakage liquid are synchronous with blood and pleural effusion after T-SPOT.TB testing, according to the final clinical diagnosis group: tuberculous pleurisy group and non tuberculous pleurisy. Regular anti-tuberculosis treatment 3 months later, with the diagnosis of tuberculous pleurisy patients, again T-SPOT.TB test on peripheral blood, with sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value as evaluation target, discussed T-SPOT.TB applied value in the diagnosis of tuberculous pleurisy. ResultsFinal diagnosis of 36 patients with tuberculous pleural effusion, peripheral blood T-SPOT.TB testing positive for 32 cases, pleurisy T-SPOT.TB testing positive for 36 cases, the sensitivity was 88.9%, 100%, respectively, non tuberculous pleural effusion patients, 24 cases of peripheral blood T-SPOT.TB test positive for 4 cases, pleural effusion T-SPOT.TB test positive for 7 cases, specificity of 83.3%, 70.8%. On peripheral blood and pleural effusion, the T-SPOT.TB test results positive predictive value, negative predictive value were 88.9%, 83.3%, 83.7% and 100% respectively. Pleural effusion spots forming cell number average is plaque forming cell number 4-6 times, anti-tuberculosis peripheral blood spots forming cells was significantly decreased after treatment.ConclusionsPeripheral blood and pleural effusion T-SPOT.TB test for the diagnosis of tuberculous pleurisy specificity and sensitivity is higher; can be diagnosed as tuberculous pleurisy a rapid and effective method. Pleural effusion T-SPOT.TB value to the diagnosis of tuberculous pleurisy is better than that of peripheral blood T-SPOT.TB testing. Before and after treatment the blood T-SPOT.TB detection of tuberculous pleurisy curative effect evaluation can be performed.

【Key words】T-SPOT.TB;Tuberculous pleurisy;Diagnosis

收稿日期：(2014-05-28)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類號(hào)： R521 A

通訊作者：崔麗英，Email: Lijiming931@sohu.com

DOI：作者單位： 010065 內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院呼吸科1;010050 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科2