基于核磁共振的中、長跑運動員大負荷訓(xùn)練課30 min后尿液代謝組學(xué)特征的研究

馬海峰，吳 瑛

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基于核磁共振的中、長跑運動員大負荷訓(xùn)練課30 min后尿液代謝組學(xué)特征的研究

馬海峰，吳 瑛

目的：基于核磁共振(NMR)代謝組學(xué)的手段，研究一堂中、長跑運動員大負荷訓(xùn)練課30 min后的代謝組學(xué)特征。方法：選取14名上海市田徑隊中、長跑組男運動員為研究對象。訓(xùn)練內(nèi)容包括：1)專項耐力:8 000 m、休息20 min；2)專項速度耐力：(500 m快跑+100 m慢跑)×16次，分為兩組(12+4),兩組間隔6 min。訓(xùn)練前和訓(xùn)練后30 min采尿樣。所有NMR實驗均在298 K溫度下，在帶有超低溫探頭的600 MHz brokerAvance III HD的核磁共振譜儀上進行。采集尿液樣品的1H NMR譜，用MestReNova V8.1.4對所有一維1H NMR譜進行處理,歸一化處理后的數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P+12.0軟件包中，進行中心化標度化處理，進行主成分分析(PCA)，最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)和正交最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA)。結(jié)果：訓(xùn)練前、后尿液樣本有明顯的區(qū)分。對訓(xùn)練前、后尿液樣本區(qū)分有貢獻的代謝物主要有：訓(xùn)練后尿液中乳酸、甘氨酸和N-氧化三甲基胺有明顯的上升，肌酐含量下降。去除乳酸和肌酐后，載荷圖顯示，訓(xùn)練后，丁酸、亮氨酸、異丁酸、乳酸、琥珀酸、次黃嘌呤、2-羥基丁酸、 2-羥基正戊酸的含量上升；丙酮酸、谷氨酰胺、檸檬酸、甲酸脂和甘氨酸的含量下降。 結(jié)論：本次訓(xùn)練課呈現(xiàn)出無氧、有氧以及混氧代謝的特點，符合現(xiàn)代中、長跑運動比賽的特點，達到了本次訓(xùn)練課的目的，訓(xùn)練有較好的效果，但也出現(xiàn)了一些較嚴重的疲勞癥狀。丁酸、異丁酸濃度在訓(xùn)練后升高，亮氨酸濃度下降有可能是有氧代謝的潛在標志性代謝物。運動后肌酐濃度下降和TMAO濃度上升，可能是大負荷訓(xùn)練造成疲勞的重要潛在生物標志物。

代謝組學(xué)；中、長跑；大負荷訓(xùn)練；運動性疲勞；核磁共振

1 前言

運動引起機體物質(zhì)和能量代謝的變化或適應(yīng)，且必然在代謝物上有所體現(xiàn)[4]。代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是20世紀90年代末期發(fā)展起來的一門學(xué)科，是自人類基因組計劃之后，迅速發(fā)展起來的以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標、以群組指標分析為基礎(chǔ)的系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)科[31]。代謝組學(xué)通過測量體內(nèi)各種代謝物濃度、比例的變化來反映機體狀況的分子集合與其功能之間的關(guān)系，客觀反映生物體整體變化的特性[17]。代謝組學(xué)研究不局限于機體受到各種外界條件影響后某個物質(zhì)或代謝通路的變化細節(jié)，而是關(guān)注機體在經(jīng)歷了一系列變化后整體性的代謝產(chǎn)物變化。區(qū)別于以往任何一種采用單一或某一方面指標的檢測方法，代謝組學(xué)研究可以更加準確和全面地反映機體狀態(tài)的整體性和動態(tài)性變化[6]。

因此，采用代謝組學(xué)研究運動人體科學(xué)問題具有很大的潛力。目前，代謝組學(xué)在體育科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用集中于運動訓(xùn)練方法手段[19,32]、運動飲料補充效果以及時機[17,26]、生理與心理應(yīng)激[40,48]等方面的研究分析。這些研究認為，代謝組學(xué)在人體運動科學(xué)領(lǐng)域是一個非常有前途和潛力的工具，它不僅能獲得全面的運動員代謝物譜信息，而且，可以系統(tǒng)地監(jiān)測機體的生理狀態(tài)并闡明運動引起的機能狀態(tài)改變，這些信息都是常規(guī)手段難以獲得的。他們認為，運用代謝組學(xué)技術(shù)可以從整體上全面系統(tǒng)的研究運動作用于機體后所引起的小分子化合物的代謝變化，尋找與運動有關(guān)的生物標志物，也可以通過全面評估不同運動形式、不同運動強度、不同運動時間以及不同運動頻率對機體所產(chǎn)生的代謝物組變化來指導(dǎo)科學(xué)合理的運動訓(xùn)練；還可以研究與運動密切相關(guān)的糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等的整體變化特征模式，進而在代謝組層面上分析運動性疲勞的機理及其恢復(fù)途徑。

以代謝組學(xué)、體育、運動、訓(xùn)練等為關(guān)鍵詞在中國知網(wǎng)、維普期刊等平臺獲得5篇論文，其中，綜述1篇，以metabolomics、metabonomics和exercise、physical activity、training為關(guān)鍵詞，在pubmed獲得11篇文章，其中，包括代謝組學(xué)研究運動對病理狀態(tài)的影響，如對冠心病、間歇性跋行、糖尿病、肥胖大鼠和超重人群等，而運用代謝組學(xué)方法研究單純運動負荷對機體的影響的報告不多，有關(guān)急性運動后正常人體的代謝組學(xué)特征，僅有3篇報告[19,26,32]。

中、長跑是典型的體能主導(dǎo)類周期性競速項目，突出特征是高速持續(xù)跑的能力，即專項速度、專項耐力、專項速度耐力等多種能力。所以，優(yōu)秀的中、長跑運動員必須具備良好的有氧、無氧、有氧—無氧混合代謝能力和突出的其他各項競技能力。中、長跑已經(jīng)不再是傳統(tǒng)觀念上的中速耐力型項目，已經(jīng)成為混氧供能和速度耐力為主的體能類競速耐力性項目。本研究基于核磁共振(NMR)代謝組學(xué)的手段，擬對一堂中、長跑運動員大負荷訓(xùn)練課進行觀察，以運動員訓(xùn)練前、后尿樣為樣本，采集代謝物圖譜，結(jié)合多變量和單變量統(tǒng)計分析，研究中、長跑運動員大負荷訓(xùn)練后變化明顯的代謝物，尋找潛在的關(guān)鍵標志物，探索這一狀態(tài)下機體代謝通路和調(diào)控機制，為預(yù)測、診斷運動員狀態(tài)，評價運動性疲勞恢復(fù)的新方法提供參考。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

選取14名上海市田徑隊中、長跑組男運動員為研究對象。運動員平均年齡17.33±1.58歲，身高173.84±3.04 cm,體重57.57±4.33 kg,體重指數(shù)(BMI)17.98±0.73，脂肪指數(shù)(FBF)11.24±1.23,最大攝氧量66.06±2.98。其中，健將級運動員5名，一級運動員6名，二級運動員3名。

2.2 訓(xùn)練課內(nèi)容

時間：2013年12月14日 (周六)上午

專項耐力:8 000 m跑；平均85 s/圈(400 m)；總時間28 min 20 s。最后5圈用時應(yīng)保持為：90-86-84-82-78(s)，休息20 min。

專項速度耐力：(500 m快跑+100 m慢跑)×16次；分為兩組(12+4)：前12次為一組(穿普通運動鞋跑)，后4次為一組(穿釘鞋跑)，兩組間隔6 min。第1組強度87-85-84-82-80 s(500 m快跑大概用時)；第2組強度：80-78-75-72 s(500 m快跑大概用時)。

訓(xùn)練課處于全年訓(xùn)練計劃準備期的后期，此階段專項能力的提高是主要任務(wù)，在有氧能力的基礎(chǔ)上，發(fā)展無氧能力，主要提高磷酸鹽系統(tǒng)、糖酵解系統(tǒng)和有氧氧化系統(tǒng)的混合供能能力。由于運動員集體住宿，在同一食堂就餐，所以容易做到統(tǒng)一作息時間，相同飲食。取樣時間為訓(xùn)練前和訓(xùn)練后30 min采尿樣[15,41](圖1)。本實驗得到實驗倫理道德委員會認可。所有運動員都了解本次實驗的目的，同意進行實驗并遵守有關(guān)實驗作息、飲食等的要求。

圖1 本研究運動員訓(xùn)練內(nèi)容及采樣流程圖Figure 1. Design of the Exercise Program and Arrows Indicate Urine Sampling

為了確定比賽的負荷強度和負荷量，本研究檢測了運動中的心率(Polars610i遙測心率表，芬蘭)和運動員主觀體力感覺量表(RPE)(采用研究人員持卷調(diào)查的方式)。

2.3 樣品收集和1H NMR譜采集

體積為500 μL尿液樣本收集在裝有20 μL1%(w/v)NaN3的EP管中，存儲在-80℃的冰箱中。進行NMR譜采集前，加入磷酸鹽重水緩沖液[1.5 M，pH 7.4，含有2.26 mM的2,2,3,3-四氘代-3-三甲基硅丁酸鈉(TSP)]，將樣品pH值控制在一個較小的范圍內(nèi)，離心(12 000 g，4℃，10 min)后，取上清(500 μL)移入5 mm NMR試管中，D2O鎖場，TSP定標(δ0.00)。

采集尿液樣品的1H NMR譜時，使用預(yù)飽和水峰的NoesyPr1d脈沖序列[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]，混合時間tm為120 ms，前兩個90°脈沖之間的t1為6.6 μs。其他參數(shù)與組織水溶性萃取液的一維NMR譜相同。128條FID，64 k個數(shù)據(jù)點，20.48 ppm的譜寬，2.66 s的采樣時間(acquisition time，ACQ)，水峰壓制是在弛豫延遲時間(recycle delay，RD)4 s內(nèi)完成。

隨機對某些樣品采集了二維預(yù)飽和水峰脈沖梯度場1H-1H相關(guān)譜(COSY)和二維帶有水門的1H-1H 總相關(guān)譜(TOCSY)，以確認一維氫譜的譜峰歸屬。所有NMR實驗均在298 K溫度下，在帶有超低溫探頭的600 MHz brokerAvance III HD的核磁共振譜儀上進行。

2.4 多變量統(tǒng)計分析

為挖掘一維1H NMR譜中的代謝物信息，本研究對所有一維1H NMR譜進行了一系列的處理：1)一維1H NMR譜在進行傅里葉變換前乘上0.3 Hz展寬的窗函數(shù)；2)傅里葉變換；3)手動調(diào)相；4)基線校正；5)參考TSP(δ 0.00)定標；6)仔細地進行峰對齊操作；7)對尿液的1H NMR譜均以0.003 ppm寬度將δ 9.50～0.50區(qū)域劃分為3 000個積分區(qū)段，以上操作均在軟件MestReNova V8.1.4(mestrelab research S.L.)中進行；8)在所有譜圖積分數(shù)據(jù)中去掉δ 5.20～4.70水峰所在的積分位置和δ 6.00～5.20尿素的寬峰信號；9)對剩余的積分數(shù)據(jù)進行歸一化處理以消除樣品之間的濃度差異；10)歸一化處理后的數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P+12.0(Umetrics,Ume?,Sweden)軟件包中進行中心化標度化處理；11)進行主成分分析(PCA)，最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)和正交最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA)。PCA和PLS-DA得分圖用第1和第2主成分來展示，OPLS-DA得分圖用第1預(yù)測主成分和1個正交成分來展示。

根據(jù)OPLS-DA模型提取變量的VIP(變量在映射中的重要性)數(shù)值，將VIP> 1的變量作為對分組有潛在貢獻的代謝物。

在Java環(huán)境下計算變量與預(yù)測主成分之間的相關(guān)系數(shù)(r)，根據(jù)r大于P=0.05時的臨界值標準來確定有顯著相關(guān)的變量，此變量對分組有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。臨界值的確定首先根據(jù)公式df=n1+n2-2計算自由度df，其中，n1、n2為OPLS-DA模型中兩組各自的樣本數(shù)，然后根據(jù)df值查詢相關(guān)系數(shù)界值表中P=0.05時相關(guān)系數(shù)的臨界值。綜上，本研究中對分組有貢獻的變量選取方法的標準有2條：VIP>1和|r|>r(臨界值P=0.05)

OPLS-DA載荷圖用來確定哪些代謝物對分組有貢獻，組間代謝物濃度差異的顯著性程度通過計算相關(guān)系數(shù)的絕對值|r|來確定，此值大于P=0.05的r臨界值，但小于P=0.01的r臨界值，在載荷圖上的顏色為黃色；此值大于P=0.01的r臨界值，在載荷圖上的顏色為紅色；值小于P=0.05的r臨界值，則顏色為藍色(圖5，圖8)。

R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum) 3個參數(shù)用來檢驗PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型的穩(wěn)健性，這些參數(shù)數(shù)值越大，模型越可靠。排列實驗圖中Q2回歸曲線截距是負的，并且所有左邊的Q2數(shù)值均低于最右邊的Q2數(shù)值，表明沒有過擬合現(xiàn)象發(fā)生(圖4，圖7)。

3 結(jié)果

對采集的尿液樣品進行NMR譜圖分析,觀察中、長跑運動員在大負荷訓(xùn)練前、后代謝模式上的差異。對照相關(guān)文獻和數(shù)據(jù)庫,對特征峰進行指認。NMR—維譜顯示，訓(xùn)練前、后運動員尿液中代謝模式區(qū)分有重要貢獻的代謝物歸屬于圖2。

表1 本研究運動員心率變化一覽表Table 1 Changes of Athletes HR

圖2 本研究訓(xùn)練前、后運動員尿液一維核磁共振氧譜特征峰的指認圖Figure 2. Two Typical 600 MHz 1H NMR NoesyPr1d Spectra (δ 0.6～4.7,6.3～9.4) of Urine Specimens from Pre (A),and Post (B) Exercise

注：(A)表示訓(xùn)練前，(B)表示訓(xùn)練后；對一維氫譜的歸屬：橫坐標是化學(xué)位移，單位是ppm,每一個代謝物在相同的緩沖液中，出峰的位置是固定的，即化學(xué)位移是固定的。譜峰的峰面積與代謝物的溶度是正相關(guān)關(guān)系，可以通過對譜峰進行積分進而做定量分析；甲酸脂(formate，F(xiàn)or)、次黃嘌呤(hypoxanthine，Hyx)、肌酐(creatinine，Cr)、甘氨酸(glycine，Gly)、N-氧化三甲基胺(N - trimethyl amine oxide，TMAO)、檸檬酸(citrate，Cit)、谷氨酰胺(glutamine ，Gln)、琥珀酸(succinate，Suc)、；丙酮酸(pyruvate，Py)、乳酸(lactate，Lac)、亮氨酸(leucine，Leu)、異丁酸(isobutyrate，IB)、丁酸(butyrate，But)、2-羥基丁酸(2-hydroxybutyrate，2HB)、 2-羥基正戊酸(2-hydroxyisovalerate，2HIV)。

本研究中，PCA、PLS-DA和OPLS-DA樣本得分圖兩組之間均有簇類分布(圖3)，OPLS-DA模型的Q2值為0.771，大于0.4，且排列實驗表明，最右邊的Q2值大于所有左邊的Q2值，R2X和R2Y分別為0.945和0.861(圖4)。這些結(jié)果表明，訓(xùn)練前、后尿液樣本有明顯的區(qū)分。

從圖5可以發(fā)現(xiàn)，對訓(xùn)練前、后尿液樣本區(qū)分有貢獻的代謝物主要有：訓(xùn)練后尿液中乳酸(Lac)、甘氨酸(Gly)和N-氧化三甲基胺(TMAO)有明顯的上升，肌酐(Cr)含量下降。

圖3 本研究訓(xùn)練前、后運動員兩組樣本尿液的多變量統(tǒng)計模型Figure 3. PCA (A),PLS-DA (B),and OPLS-DA (C)Scores Plots of 1H NMR Data of Pre and Post-Exercise Groups

注：主成分分析得分圖(A)，偏最小二乘法-監(jiān)督分析得分圖(B)，正交偏最小二乘法-監(jiān)督分析得分圖(C)；TB表示訓(xùn)練前，TA表示訓(xùn)練后。

圖4 本研究訓(xùn)練前、后運動員兩組樣本尿液OPLS-DA可靠程度排列實驗圖Figure 4. Permutation Tests Derived from PLS-DA Models with the 6-round Cross Validation

注：深黑色的方塊所在的位置指示Q2的值，如果深黑色直線最左邊的Q2值大于所有右邊的Q2值，則說明此OPLS-DA模型是可信的，否則是過擬合的，結(jié)果不可信。Q2表征模型的可信程度，一般認為Q2的值大于0.4，可信程度較高，R2X和R2Y表征本模型能夠解釋的變量的百分數(shù)，越高越好。

圖5 本研究運動員訓(xùn)練前、后各代謝物OPLS-DA載荷圖Figure 5. OPLS-DA Loading Plots of 1H NMR Data from Pre vs.Post-Exercise Group

注：相關(guān)系數(shù)|r|和VIP(變量在影射中的重要性)是考察哪些代謝物對分組有意義的參數(shù)，相關(guān)系數(shù)|r|大于P為0.05時的臨界值和VIP大于1，作為對分組有貢獻的代謝物的選擇標準。

圖6 本研究去除乳酸和肌酐積分值后訓(xùn)練前、后運動員兩組樣本尿液的多變量統(tǒng)計模型Figure 6. The Scores Plots of PCA (A),PLS-DA (B),and OPLS-DA (C) Derived from 1H NMR Data of Pre and Post-Exercise Groups with the Signals of Lactate were Excluded

注：主成分分析得分圖(A)，偏最小二乘法-監(jiān)督分析得分圖(B)，正交偏最小二乘法-監(jiān)督分析得分圖(C)；TB表示訓(xùn)練前，TA表示訓(xùn)練后。

圖7 本研究去除乳酸和肌酐積分值后訓(xùn)練前、后運動員兩組樣本尿液OPLS-DA可靠程度排列實驗圖Figure 7. Permutation Tests Derived from PLS-DA Models with the 6-Round Cross Validation with the Signals of Lactate were Excluded

因為訓(xùn)練后乳酸和肌酐的含量變化劇烈，將這兩個代謝物的積分值略去后，再進行進一步的多變量統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練前、后樣本的區(qū)分顯著。

PCA、PLS-DA和OPLS-DA樣本得分圖兩組之間均有簇類分布(圖6)，OPLS-DA模型的Q2值為0.722，大于0.4，且排列實驗表明，最右邊的Q2值大于所有左邊的Q2值，R2X和R2Y分別為0.436和0.85(圖7)。這些結(jié)果表明，訓(xùn)練前、后尿液樣本有明顯的區(qū)分。

圖8 本研究去除乳酸和肌酐后各代謝物OPLS-DA載荷圖Figure 8. OPLS-DA Loading Plots of 1H NMR Data from Pre vs.Post-Exercise Group with the Signals of Lactate were Excluded

由去除乳酸和肌酐后載荷圖發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練后，丁酸(But)、亮氨酸(Leu)、異丁酸(IB)、乳酸(Lac)、琥珀酸(Suc)、次黃嘌呤(Hyx)、2-羥基丁酸(2HB)、 2-羥基正戊酸(2HIV)的含量上升；丙酮酸(Pyr)、谷氨酰胺(Gln)、檸檬酸Cit)、甲酸脂(For)和甘氨酸(Gly)的含量下降。這些代謝物涉及到能量代謝和氧化應(yīng)激等代謝途徑。

4 討論

現(xiàn)代中、長跑訓(xùn)練以混和代謝為主，有氧代謝為輔，并注重?zé)o氧代謝能力的發(fā)展。中、長跑訓(xùn)練時，內(nèi)容負荷的安排會在鞏固有氧代謝的基礎(chǔ)上，著眼于混氧代謝能力的發(fā)展。有研究指出，中、長跑訓(xùn)練要高度重視運動員的無氧、高強度混氧與低強度混氧的跑量。增加中等以上強度和大強度的訓(xùn)練量，提高運動員機體的快速供能能力，保證訓(xùn)練質(zhì)量是當(dāng)今中、長跑運動訓(xùn)練負荷的一個突出特點[11]。胡泓等[3]提出，中、長跑訓(xùn)練不是僅僅發(fā)展有氧代謝，還要大量從事無氧代謝、混氧代謝方面的訓(xùn)練。本研究中的訓(xùn)練課就是以這種訓(xùn)練理念為基礎(chǔ)，在訓(xùn)練課內(nèi)容第1部分以持續(xù)訓(xùn)練法發(fā)展有氧耐力的基礎(chǔ)上，第2部分以間歇變速跑手段，加強運動員有氧和無氧混合供能的能力。

在傳統(tǒng)的運動生化測試中，一次訓(xùn)練課的負荷常采用血乳酸、血尿素等指標，有時也采用尿蛋白、磷酸肌酸激酶和心率等輔助指標[7]。代謝組學(xué)技術(shù)與過去的生化檢測方法相比，能更加全面和敏感地反映人體代謝模式的變化，在運動人體科學(xué)中具有很明顯的方法學(xué)優(yōu)勢和應(yīng)用前景[4,13]。基于核磁共振 (NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)能夠量化所有小分子代謝物，從而全面監(jiān)測機體對各種刺激反應(yīng)的波動[22,33,49]。而且，傳統(tǒng)的運動生物化學(xué)方法主要采用血液為樣本，對尿液中物質(zhì)含量進行測定相對較少[41]。而代謝組學(xué)研究卻經(jīng)常采用尿液作為代謝樣本，Wallner-Liebmann等[45]認為，尿液既植入了非常多的日常生活的信號，也有著非常清晰的代謝組學(xué)信號，甚至已經(jīng)初步建立了一個基于尿液代謝組學(xué)的檢測標準，以觀察藥物、生活方式、膳食補充劑以及疾病對人體代謝信號的影響。在運動人體科學(xué)的研究中，尿液作為樣本也有著非常大的實踐意義。尿液是機體代謝的終端，能反映出體內(nèi)所有生物調(diào)節(jié)過程。盡管尿液中物質(zhì)的排泄與腎臟調(diào)節(jié)支配有一定聯(lián)系[29]，但尿液中代謝物的濃度還是在很大程度上與血液中代謝物濃度高度相關(guān)。最關(guān)鍵的是，尿液采集是無創(chuàng)的方法，對運動員和教練員來說更容易接受，對采集者來說具有更大的便利性和很強的可操作性。

本研究基于NMR代謝組學(xué)的手段，對上海市中、長跑運動員一堂大負荷訓(xùn)練課進行觀察，訓(xùn)練課處于全年訓(xùn)練計劃準備期的后期，此階段專項能力的提高是主要任務(wù)，在有氧能力的基礎(chǔ)上，發(fā)展無氧能力，主要提高磷酸鹽系統(tǒng)、糖酵解系統(tǒng)和有氧氧化系統(tǒng)的混合供能能力。預(yù)期在尿樣代謝物分析中，應(yīng)能發(fā)現(xiàn)ATP再合成、糖、蛋白質(zhì)、脂肪等能源物質(zhì)以無氧、有氧代謝混合供能方式存在的證據(jù)。

心率(HR)是每分鐘心臟搏動的次數(shù)，是訓(xùn)練監(jiān)控的常用生理指標。心率隨運動員運動強度的加大而加快，可反映運動強度和機體的代謝水平。運動員運動時心率，分為極限負荷心率(心率達到185次/min 以上)、次極限負荷心率(170次/min 左右)和一般負荷心率(150次/min 左右)。在運動中常用心率控制有氧運動的強度和間歇訓(xùn)練的間歇時間，評定訓(xùn)練課的生理負荷量、運動員訓(xùn)練程度、機能狀態(tài)及心儲備功能等[10]。本次訓(xùn)練課的14名運動員平均HR為168±2.9次/min，最高心率達到202±3.1次/min(表1)，反映本次訓(xùn)練強度和量都很大,總負荷值達到大負荷程度。RPE調(diào)查結(jié)果顯示，所有運動員在訓(xùn)練后，主觀體力感覺都達到了非常疲勞的程度。

通過代謝組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，運動員運動后與運動前尿樣具有明顯不同的代謝組學(xué)圖譜(圖2)。對訓(xùn)練前、后尿液樣本區(qū)分有較大貢獻的代謝物主要有：訓(xùn)練后尿液中乳酸、甘氨酸和N-氧化三甲基胺有明顯的上升，肌酐含量下降。在排除乳酸和肌酐的信號后(Enea[19]的研究排除了尿素、肌酐和乳酸信號；Pechlivanis等[32]的研究排除了乳酸信號)，載荷圖顯示，訓(xùn)練后，丁酸、亮氨酸、異丁酸、琥珀酸、次黃嘌呤的含量上升；丙酮酸、谷氨酰胺、檸檬酸、甲酸酯含量下降，這些代謝物涉及到氨基酸代謝、能量代謝和氧化應(yīng)激等代謝途徑。和其他有關(guān)單純運動因素導(dǎo)致的代謝物變化的研究[5,19,32]相比，本研究結(jié)果和他們大體一致并有著本次訓(xùn)練課自己的特點。

4.1 磷酸原系統(tǒng)

磷酸肌酸和肌酸是再合成ATP的最快能量儲備，能夠反映機體短時間快速供能能力。肌酐是體內(nèi)磷酸肌酸或肌酸的代謝產(chǎn)物，磷酸肌酸和肌酸在人體內(nèi)組成肌酸池，是能量利用和儲存的重要物質(zhì)。人體內(nèi)大約95%的肌酸池存在于骨骼肌中，在骨骼肌中，磷酸肌酸約占總肌酸池的2/3。磷酸肌酸在分解過程中，可脫去1分子磷酸轉(zhuǎn)變成肌酐，肌酸也可脫水轉(zhuǎn)變成肌酐。人體在正常狀態(tài)下肌酐水平的升高暗示著腎功能紊亂并伴隨著心血管疾病的危險[43]。大運動量訓(xùn)練后，血清肌酐濃度稍有上升，運動引起的血清和尿液中肌酐濃度的增高，反映了肌細胞內(nèi)肌酸的釋放和循環(huán)的加強。尿肌酐在運動員機能評定中常被作為速度、力量素質(zhì)的選材、訓(xùn)練效果等檢測指標，其數(shù)值高是肌肉機能好的反映。反之，可能是肌肉機能下降的表現(xiàn)[2]。Enea[19]、Pechlivanis等[32]和黃彩華[5]的研究發(fā)現(xiàn)，大強度短時間訓(xùn)練或比賽后，代謝物中肌酐含量上升，可能是他們所采用的短時高強度的運動負荷，會反射性地加強肌細胞釋放肌酸的能力。本研究中肌酐含量在運動后出現(xiàn)下降趨勢，推斷是由于訓(xùn)練課中這種持續(xù)時間較長，采用組間休息時間較短的間歇訓(xùn)練法的大負荷訓(xùn)練課導(dǎo)致了運動員肌酸池儲能下降，肌肉機能下降。雖然尿肌酐的排出量主要與肌肉質(zhì)量和磷酸肌酸含量有關(guān)，不受訓(xùn)練強度和負荷量的影響，但本研究認為，肌酐含量在運動后下降可能是大負荷訓(xùn)練造成疲勞的標志之一。

4.2 無氧酵解系統(tǒng)

在短時間大強度運動時,大約80%的能量來自機體的無氧代謝和糖酵解代謝[36,39]，主要表現(xiàn)在嘌呤分解代謝的活躍和乳酸的產(chǎn)生[24]。次黃嘌呤升高提示運動員體內(nèi)核苷酸分解代謝提供能量過程加強，也可能提示是細胞內(nèi)處于缺氧和氧化應(yīng)激狀態(tài)。遞增負荷引起機體的氧化應(yīng)激在多個研究中已經(jīng)被觀察到[16,37,44]。次黃嘌呤(Hypoxanthine)也稱“6-羥基嘌呤”，是一種天然存在的嘌呤衍生物。它的核苷酸肌苷酸是核酸的嘌呤核苷酸的合成前體。在核苷酸合成中，次黃嘌呤在次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤账?IMP)。在恢復(fù)期間,大部分的IMP可迅速再合成為ATP,且一小部分進一步分解,導(dǎo)致次黃嘌呤的產(chǎn)生[42,47]。研究發(fā)現(xiàn)，通過對機體血樣次黃嘌呤變化的觀察可以監(jiān)測有機體細胞內(nèi)的能量代謝情況。還有研究指出，次黃嘌呤是形成超氧自由基的酶促反應(yīng)底物，被認為是組織缺氧的標志[20]。本研究結(jié)果與另外的急性運動的代謝組學(xué)研究結(jié)果一致[19,25]，提示，本次訓(xùn)練課過程中，運動員機體處于缺氧和氧化應(yīng)激狀態(tài)。

人體的這種缺氧和氧化應(yīng)激狀態(tài)會引起乳酸增加。當(dāng)人處于缺氧或劇烈運動時，細胞供氧不足，線粒體內(nèi)丙酮酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化分解過程受抑制，從而導(dǎo)致丙酮酸和NADH在細胞質(zhì)基質(zhì)中大量積累，加快了乳酸的生成。乳酸是人體代謝過程中的一種重要中間產(chǎn)物，它與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝以及細胞內(nèi)的能量代謝關(guān)系密切。乳酸源于葡萄糖和糖元的酵解過程。運動時，隨著細胞內(nèi)ATP和CP的消耗，細胞質(zhì)內(nèi)的ADP、AMP、Pi和肌酸大大增加，激活了細胞內(nèi)的糖分解過程，產(chǎn)生大量的丙酮酸和NADH，而且，其生成速率遠遠超過線粒體內(nèi)的氧化速率，因此，丙酮酸和NADH在細胞質(zhì)基質(zhì)中大量積累，導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生較多的乳酸。雖然很少有常規(guī)的實驗報告提及尿中乳酸指標可以反映運動機能[29]，但Pechlivanis等[32]同時用傳統(tǒng)的方法在實驗中測得乳酸和肌酐濃度比值，發(fā)現(xiàn)和1H NMR測試結(jié)果高度相關(guān)，也證實了1H NMR測試的有效性。本實驗和其他3個類似實驗[5,19,32]都出現(xiàn)了運動后代謝物中乳酸大量增加的現(xiàn)象，提示本次實驗的訓(xùn)練課中運動員糖酵解系統(tǒng)供能的證據(jù)。而琥珀酸這種厭氧代謝的發(fā)酵產(chǎn)物之一在訓(xùn)練后濃度上升也說明了這一現(xiàn)象。

4.3 有氧氧化系統(tǒng)

脂肪酸在有充足氧供給的情況下，可氧化分解為CO2和H2O，釋放大量能量，因此，脂肪酸是機體主要能量來源之一。在長時間、大負荷訓(xùn)練狀態(tài)下，血漿游離脂肪酸濃度升高，以便各組織細胞攝取后氧化供能。此外，脂肪酸不完全氧化生成的酮體可以作為能源，提供給骨骼肌和腦部神經(jīng)系統(tǒng)氧化利用。酮體是脂肪酸在肝臟進行正常分解代謝所生成的特殊中間產(chǎn)物，包括有乙酰乙酸(約占30%)、2-羥基丁酸(2HB) (約占70%)和極少量的丙酮[1]。正常人血液中酮體含量極少，這是人體利用脂肪氧化供能的正?，F(xiàn)象。人體持續(xù)運動到一定時間時，為補償糖代謝的不足，有機體通過促進脂肪氧化來滿足運動系統(tǒng)的需要。本實驗中，2HB等酮體生成明顯增加，另外，脂肪酸代謝的產(chǎn)物也明顯升高，短鏈脂肪酸 (SCFAs)(丁酸、異丁酸)等濃度均明顯升高。SCFAs是最重要的在遠端腸道發(fā)酵的最終產(chǎn)品和間接營養(yǎng)身體的物質(zhì)。丁酸鹽是腸道能量的主要來源[34]。丁酸鹽在腸道內(nèi)的氧化供應(yīng)超過70%的能量，從而減少葡萄糖氧化和儲備谷氨酰胺和丙酮酸[23]。丁酸在細胞線粒體中通過b-氧化通路代謝，然后進入檸檬酸作為乙酰輔酶a，和草酰乙酸一起，通過檸檬酸合成酶共同生成檸檬酸。檸檬酸可以進一步在檸檬酸循環(huán)代謝的電子傳遞鏈生成電子，推動ATP生成[23,46]。本研究中，檸檬酸等有氧代謝的中間產(chǎn)物濃度也顯著升高,提示，運動員有氧代謝活動增強；糖和脂肪酸的有氧氧化分解在本次訓(xùn)練課能量代謝中發(fā)揮重要作用。

在Pechlivanis等[32]的研究中，即使是短時間的運動，也有酮體的變化，但有關(guān)脂肪酸代謝的產(chǎn)物均沒有變化，如丁酸、異丁酸等濃度。而黃彩華[5]的研究中，即使是號稱有氧代謝占優(yōu)勢的花劍比賽，脂肪酸代謝產(chǎn)物也沒有變化?？赡芡w是脂肪酸不完全氧化的產(chǎn)物，在缺氧的情況下也會生成。而丁酸、異丁酸是脂肪酸在氧充足環(huán)境中產(chǎn)生，提示丁酸、異丁酸有可能是有氧代謝的潛在標志性代謝物。

4.4 氨基酸和支鏈氨基酸

氨基酸(Amino acid)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，內(nèi)環(huán)境中的氨基酸,一部分進行蛋白質(zhì)的再合成，一部分轉(zhuǎn)化為嘌呤等含氮化合物,或脫羧基轉(zhuǎn)化為胺類,其余的則脫氨基進入氧化代謝。因此,嘌呤、胺類、在血中的濃度也會隨之升高[9]。有研究認為，力量性運動員在經(jīng)過各種形式的訓(xùn)練后10 min，除少數(shù)氨基酸因為轉(zhuǎn)氨基、三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物再合成而含量升高之外，大部分血清氨基酸含量都是下降的[35]。谷氨酰胺(Gln)是最常見的20多種氨基酸中的一種，是肌肉中最豐富的游離氨基酸，約占人體游離氨基酸總量的60%。谷氨酰胺不是必需氨基酸，在人體內(nèi)可由谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸合成。免疫細胞的增殖和保持正常功能都高度依賴谷氨酰胺[14]。高強度的訓(xùn)練會干擾免疫系統(tǒng)，增加體內(nèi)乳酸及銨的水平。高水平的銨會影響肌肉功能。谷氨酰胺可以調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)血氨的水平，緩沖乳酸，降低氨和乳酸對細胞的不良影響；在訓(xùn)練開始5 min內(nèi)，谷氨酰胺水平會上升，釋放分解激素，訓(xùn)練中肌肉繼續(xù)釋放谷氨酰胺，導(dǎo)致其水平下降。訓(xùn)練強度越高，谷氨酰胺流失速度越快。血漿谷氨酰胺水平可作為過度訓(xùn)練的一個重要指標。在進行高強度力量訓(xùn)練時，體內(nèi)谷氨酰胺的水平有可能下降達50%。此時，若不能通過飲食或自身合成得到補充，肌肉蛋白就會發(fā)生分解，以滿足機體對谷氨酰胺的需求。這種現(xiàn)象既會影響肌肉的體積，也會由于免疫系統(tǒng)的谷氨酰胺主要來源于骨骼肌的釋放，從而導(dǎo)致機體的免疫力降低。長時間、力竭性運動后，血漿谷氨酰胺水平更低，有的人可能維持低水平達幾周、幾個月甚至數(shù)年之久。本研究訓(xùn)練采用的負荷性質(zhì)也是這種長時間、力竭性運動，其谷氨酰胺水平顯著下降，研究提示，大負荷訓(xùn)練對體內(nèi)能量儲備有著巨大的需求，導(dǎo)致了血漿中谷氨酰胺濃度的降低，可能引起肌肉縮小、肌肉損耗、細胞脫水和肌肉萎縮等不利于運動能力提高的癥狀。

與此不同，甘氨酸濃度在訓(xùn)練后顯著上升。甘氨酸(Gly)是最簡單的氨基酸，又名氨基乙酸，參與嘌呤類、卟啉類、肌酸和乙醛酸的合成，可與多種物質(zhì)結(jié)合，由膽汁或從尿中排出。在醫(yī)藥方面，甘氨酸單獨使用可治療重癥肌無力等營養(yǎng)失調(diào)癥，促進脂肪代謝；丙氨酸的增加,琥珀酸的減少和甘氨酸的消費被視為能源生產(chǎn)和核苷酸從頭合成的信號[21]。劉靖等[8]通過觀察甘氨酸對正常飲食和高脂飲食小鼠體重及血脂代謝的影響研究發(fā)現(xiàn)，Gly對正常飲食和高脂飲食的小鼠都有降低體重和體脂含量的作用,并能降低血脂。王磊等[9]在優(yōu)秀游泳運動員冬訓(xùn)的代謝組檢測中，甘氨酸明顯升高。左群等[28]利用HPLC法測試大鼠一次性90 min持續(xù)下坡跑，發(fā)現(xiàn)運動后1 h內(nèi)血清與骨骼肌中甘氨酸呈上升趨勢。但是，短時、大強度的急性運動導(dǎo)致的代謝物中甘氨酸濃度都呈下降或不變趨勢[19,32]。只有以長時間有氧代謝為主要供能方式的花劍比賽呈現(xiàn)和本研究同樣的結(jié)果[5]，提示，甘氨酸濃度上升可能是機體脂肪代謝供能比例上升的標志。

4.5 N-氧化三甲基胺(N - trimethyl amine oxide ，TMAO)

目前，研究N-氧化三甲基胺(TMAO)在人體中的生物學(xué)作用的文章較少[27]。自從出現(xiàn)了代謝組學(xué)分析，TMAO才被研究者們從大量的代謝物中篩選出來，并引起高度關(guān)注。在臨床研究中，TMAO是缺血性腎損傷的生物標示物，其濃度變化常常與腎功能損傷和腸道菌群紊亂聯(lián)系在一起。研究證實，腸道菌群在人類形成TMAO過程中必不可少，而且，TMAO水平與將來心臟病發(fā)作、卒中和死亡之間有一定關(guān)系，即使在確定的無心臟病風(fēng)險者中依然如此[12]。最近的一項研究表明，腸道菌群的細胞轉(zhuǎn)錄是依賴TMAO做為磷酸化開關(guān)，選擇有氧氧化和厭氧作用[18,27]。

研究顯示，在體內(nèi)pH下降和溫度升高時，TMAO降解速度加快[30]。運動時體內(nèi)酸性物質(zhì)大量積累，溫度升高，可能是運動時TMAO下降的重要原因。但本研究中，TMAO有明顯的上升，原因可能和運動員運動時間和負荷的大小有關(guān)。對比其他有關(guān)急性運動對代謝組學(xué)的影響的研究，TMAO的濃度都是無變化和下降[19,32]，本研究認為，這是因為他們所采用的負荷量度都比較小，而本次訓(xùn)練課運動員最高心率達到202±3.1次/min，RPE疲勞量表中運動員疲勞程度也較大。雖然機制尚不明確，但由于TMAO對本實驗運動前、后分組的貢獻很大，本研究認為，TMAO很可能是運動過程中代謝調(diào)節(jié)的重要生物標志物，提示，TMAO 可以作為一個急性運動性疲勞的潛在標志性代謝物。

另外，美國克里夫蘭診所(Cleveland Clinic in Ohio)的斯坦利·哈森(Stanley Hazen)研究認為，吃紅肉和蛋白質(zhì)較多的人，腸內(nèi)細菌合成TMAO的效率也高一些，提示，高蛋白飲食在中、長跑訓(xùn)練和比賽中TMAO生成效率變高，可能導(dǎo)致疲勞更早出現(xiàn)和程度加深，正應(yīng)了教練員們對賽前飲食的一句俗話“吃蛋得蛋”，體內(nèi)TMAO水平高可能是這種現(xiàn)象的機制之一。

雖然，本研究基于NMR的代謝組學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)中、長跑運動員一堂大負荷訓(xùn)練課后30 min的一些代謝特征和潛在的關(guān)鍵標示物，但由于與本研究相關(guān)的報告很少，能夠借鑒和比較的案例不足以區(qū)分類似本次訓(xùn)練課的特點，因此，以后應(yīng)在此基礎(chǔ)上進行更多的實驗以證實這些標志物。

5 結(jié)論

1.中、長跑運動員一次大負荷訓(xùn)練前、后尿液樣本的NMR代謝譜存在差異，可從代謝組學(xué)分析中找出特異的標志性代謝產(chǎn)物。

2.基于NMR運動員尿液代謝組學(xué)的評價，本次訓(xùn)練課后30 min運動員機體呈現(xiàn)出無氧、有氧以及混氧代謝的特點，符合現(xiàn)代中、長跑運動比賽的特點，達到了本次訓(xùn)練課的目的，訓(xùn)練有較好的效果，但也出現(xiàn)了一些較嚴重的疲勞癥狀。

3.和無氧代謝占較大比例的短時、大強度運動負荷相比，本次訓(xùn)練課后30 min運動員尿液代謝物中和有氧代謝相關(guān)的丁酸、異丁酸濃度升高，丁酸、異丁酸有可能是類似本次訓(xùn)練課這種混氧能力訓(xùn)練的標志性代謝物。

4.N-氧化三甲胺(TMAO)是大負荷訓(xùn)練代謝調(diào)節(jié)中重要的生物標志物，未來可以開發(fā)為敏感的、特異的運動性疲勞的監(jiān)控指標，其涉及的調(diào)節(jié)通路可能為運動營養(yǎng)補劑的研發(fā)提供新的靶點。

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1H NMR-Based Metabonomic Investigation of the Characteristic of Human Urine 30 min after a Heavy Load Training Class on the Middle & Long-distance Race Athletes

MA Hai-feng,WU Ying

Objective:This paper,basing on the means of nuclear magnetic resonance (NMR),studied a middle&long-distance race athletes metabonomics characteristic 30min after a class of heavy load training.Methods:14 male athletes from Shanghai athletic team were chosen as subjects.The training class included:A special endurance:8 000m;B special speed-endurance(500m faster+100m slower)*16.The urine samples were collected before and after 30min from training.Aliquots of urine sample were thawed for metabonomic analysis through1H NMR spectroscopy.All NMR experiments were carried out at 300K on a Bruker (Karlsruhe,Germany) Avance III 600 MHz spectrometer equipped with an ultra-low temperature probe.The FIDs processing was conducted using the software MestReNova Version 8.1.4 (Mestrelab Research S.L.).The normalized integral values were mean centered for principal component analysis (PCA),partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA),and orthogonal projection of latent-structure-discrimination analysis (OPLS-DA) by SIMCA-P+ software package (ver.12.0,Umetrics AB,Ume?,Sweden).Results:NMR spectra of urine samples were dominated by the numerous signals from lactate,creatinine,N-oxide,The metabolites of concentration rising included,butyrate,leucine,isobutyrate,lactate,succinate,hypoxanthine,2-hydroxybutyrate,2-hydroxyisovalerate;The metabolites of concentration declining included pyruvate,glutamine,citrate,formate and glycine.Conclusion:This class presents the characteristics of anaerobic,aerobic and mixed oxygen metabolism,and conforms to the characteristics of modern middle & long-distance race,and achieves the purpose of the training class and gets a effectiveness.The rising of butyrate and isobutyrate after the training may be a key metabolism of aerobic.The declining of creatinine and rising of TMAO may be the key metabolisms of fatigue due to heavy load training.

metabonomic;middle&long-distancerace;heavyloadtraining;exercisefatigue;NMR

1000-677X(2015)07-0048-09

10.16469/j.css.201507006

2014-11-06；

2015-06-29

上海市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(13490503700)。

馬海峰(1970-)，男，安徽宿州人，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為體能訓(xùn)練及中醫(yī)針灸與運動訓(xùn)練，Tel：(021)51253201，E-mail：mahf1970@sus.edu.cn；吳瑛(1957-)，男，山東蓬萊人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：wuying5766@163.com。

上海體育學(xué)院，上海 200438 Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

G804.7

A