高效液相色譜手性流動(dòng)相法測(cè)定鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體含量

金麗，周建麗，張曉丹，古卓良，卜瑩

(南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，南京 210002)

高效液相色譜手性流動(dòng)相法測(cè)定鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體含量

金麗，周建麗，張曉丹，古卓良，卜瑩

(南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，南京 210002)

目的 建立腎上腺素光學(xué)異構(gòu)體中S-對(duì)映體的高效液相色譜手性流動(dòng)相檢測(cè)方法。方法 Purospher?STAR RP-18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1手性添加劑磺丁基-β-環(huán)糊精，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。結(jié)果 腎上腺素S-對(duì)映體在濃度5.02～501.50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 7，檢測(cè)限0.05 μg·mL-1。結(jié)論 該方法重復(fù)性、耐用性好，適用于鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體雜質(zhì)含量的測(cè)定。

腎上腺素注射液，鹽酸；色譜法，高效液相；手性流動(dòng)相；添加劑；S-對(duì)映體

腎上腺素為腎上腺素受體激動(dòng)藥，對(duì)β1和β2受體均有較強(qiáng)的興奮作用，臨床主要用于心搏驟停、支氣管哮喘、過(guò)敏性休克，也可用于治療蕁麻疹、枯草熱及鼻黏膜或牙齦出血等[1]。鹽酸腎上腺素注射液是腎上腺素的主要?jiǎng)┬?，為《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)收載品種。此外，《美國(guó)藥典》(USP35)、《英國(guó)藥典》(BP2010)和《日本藥局方》(JP15)中也均有收載。腎上腺素為鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中有一個(gè)手性碳原子，所以有兩個(gè)手性對(duì)映體，即R-對(duì)映體和S-對(duì)映體，二者與腎上腺素受體的親和力和內(nèi)在活性有明顯的差異，R-對(duì)映體對(duì)血管的收縮作用比S-對(duì)映體強(qiáng)十幾倍[2]。因此，各國(guó)藥典均采用腎上腺素R-對(duì)映體。但腎上腺素在合成過(guò)程中可能由于拆分不完全而殘留S-對(duì)映體；同時(shí)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，注射液中的腎上腺素在也會(huì)發(fā)生消旋化反應(yīng)而產(chǎn)生S-對(duì)映體，這都會(huì)導(dǎo)致腎上腺素的藥理活性下降[3]。因此，有必要對(duì)鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體的含量加以控制。目前，腎上腺素對(duì)映體的拆分以毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法為主[3-5]，但研究多側(cè)重于腎上腺素消旋體的拆分方法，僅金微等[6]報(bào)道毛細(xì)管電泳法對(duì)不同鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體含量的測(cè)定。筆者針對(duì)基層檢驗(yàn)單位的實(shí)際情況，采用應(yīng)用更廣的高效液相色譜法以含有手性添加劑流動(dòng)相測(cè)定鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體的含量，并對(duì)國(guó)內(nèi)7個(gè)廠家的101批次產(chǎn)品的S-對(duì)映體含量進(jìn)行分析考察，以期為鹽酸腎上腺素注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 型高效液相色譜儀：包括二元泵、光電二極管陣列檢測(cè)器、Chem Station 色譜數(shù)據(jù)工作站(美國(guó)安捷倫公司)；PHS-3C型酸度計(jì)(上海精密儀器廠)；MS105電子天平、AL104電子天平(Mettler Toledo)。

1.2 試藥 鹽酸腎上腺素(鹽酸腎上腺素R-對(duì)映體)注射液(來(lái)自國(guó)內(nèi)7個(gè)廠家，共101批次，規(guī)格：1 mg：1 mL)；鹽酸腎上腺素消旋體(R，S-對(duì)映體)(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：SLBG5626V，純度以100%計(jì))；腎上腺素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100154-201104，純度：99.7%)；磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD，西亞試劑公司，批號(hào)：F2503，純度：98%)；磷酸、磷酸二氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、鹽酸均為分析純，乙腈為色譜純，水為新制重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 系統(tǒng)適用性溶液 稱取鹽酸腎上腺素消旋體適量(相當(dāng)于腎上腺素消旋體10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水適量使溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.2 腎上腺素對(duì)照品溶液 稱取腎上腺素對(duì)照品(R-對(duì)映體)約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加稀鹽酸1 mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 取規(guī)格為1 mg：1 mL的鹽酸腎上腺素注射液直接測(cè)定。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Purospher?STAR RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1磺丁基-β-環(huán)糊精，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性 在上述色譜條件下，腎上腺素R-對(duì)映體和S-對(duì)映體分離度良好(Rs>1.9)，理論板數(shù)按R-對(duì)映體計(jì)>9 000，見(jiàn)圖1。

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸腎上腺素消旋體120.3 mg(相當(dāng)于腎上腺素消旋體100.3 mg)置100 mL量瓶中，加水適量使溶解，并定容，搖勻，制成1.003 mg·mL-1腎上腺素消旋體貯備液。分別精密量取儲(chǔ)備液1，2，4，10，20，40 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得梯度濃度分別為5.02，10.03，20.06，50.15，100.30，200.60，501.50 μg·mL-1的腎上腺素S-對(duì)映體溶液。采用“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以色譜圖中腎上腺素S-對(duì)映體的峰面積(A)對(duì)其濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得線性方程和相關(guān)系數(shù)分別為：A=13.351C-26.876，R2=0.999 7。腎上腺素S-對(duì)映體在濃度5.02～501.50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，適合于低濃度范圍S-對(duì)映體雜質(zhì)的檢測(cè)。

2.4 檢測(cè)限 精密量取“2.3”項(xiàng)腎上腺素消旋體貯備液逐級(jí)定量稀釋，進(jìn)樣并記錄色譜圖，按信噪比(S/N)為3計(jì)算檢測(cè)限。S-對(duì)映體的最低檢測(cè)濃度為0.05 μg·mL-1。

2.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，按歸一化法計(jì)算供試品中腎上腺素S-對(duì)映體的平均含量為1.51%，RSD為0.25%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。取供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件在0，4，8，12，24 h測(cè)定，按面積歸一化法計(jì)算供試品中腎上腺素S-對(duì)映體含量的RSD為0.98%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

Fig.1 Chromatograms of(±)epinephrine hydrochloride(A)，epinephrine standard(B)and epinephrine hydrochloride injection(C)

2.6 耐用性考察 取供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，再選擇Shim-pack VP-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱測(cè)定S-對(duì)映體的含量，計(jì)算兩種色譜柱測(cè)得S-對(duì)映體含量的RSD為1.25%。結(jié)果表明該方法具有較好的耐用性。

2.7 樣品S-對(duì)映體含量的測(cè)定 對(duì)101批次鹽酸腎上腺素注射液按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件逐批檢測(cè)，按面積歸一化法計(jì)算S-對(duì)映體的百分含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。S-對(duì)映體的百分含量范圍為1.31%～9.15%。

圖2 7家企業(yè)101批次鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體的百分含量

Fig.2 Percentage ofS-isomer in 101 batches of epinephrine hydrochloride injections from 7 manufacturers

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 手性添加劑濃度的優(yōu)化 手性添加劑的濃度是影響腎上腺素R、S-對(duì)映體分離的一個(gè)重要的因素，通過(guò)調(diào)整手性添加劑的濃度，可使R、S-對(duì)映體達(dá)到最佳分離。在乙腈-10 mmol·L-1的磷酸二氫鈉緩沖液中(用磷酸調(diào)節(jié)pH3.0)添加SBE-β-CD，使其濃度分別為2.5，5，10和20 mmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)SBE-β-CD濃度逐漸加大時(shí)，R、S-對(duì)映體的保留時(shí)間隨之增加，同時(shí)分離度隨之增大。考慮到SBE-β-CD濃度過(guò)大對(duì)色譜柱損傷較大且流動(dòng)相也更易霉變，故最終選擇10 mmol·L-1的SBE-β-CD作為手性添加劑的濃度。

3.1.2 緩沖液pH的優(yōu)化 用磷酸將含10 mmol·L-1SBE-β-CD的10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)至不同的pH：2.0，2.5，3.0，3.5，分離腎上腺素R、S-對(duì)映體。結(jié)果表明：在pH 2.0～3.5范圍內(nèi)，隨著pH的增大，R、S-對(duì)映體的保留時(shí)間呈增加趨勢(shì)，而分離度變化不明顯?？紤]pH較高時(shí)，R、S-對(duì)映體保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本研究選擇pH3.0的10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1SBE-β-CD)-乙腈(98：5：1.5)為流動(dòng)相。

3.2 樣品結(jié)果分析 101批次鹽酸腎上腺素注射液中均檢出S-對(duì)映體，含量為1.31%～9.15%。其中1家公司(簡(jiǎn)稱為A公司)產(chǎn)品的S-對(duì)映體的含量均>6%(n=25)，1家公司(簡(jiǎn)稱為B公司)產(chǎn)品的S-對(duì)映體含量均<3%(n=27)。比較兩公司產(chǎn)品的pH發(fā)現(xiàn)，A公司的產(chǎn)品(pH均值為3.0，n=25)的pH低于B公司產(chǎn)品(pH均值為3.5，n=27)，表明產(chǎn)品pH與S-對(duì)映體的含量有一定的相關(guān)性。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定不同pH值的模擬鹽酸腎上腺素注射液中S-對(duì)映體含量。結(jié)果pH在3.5～5.5之間，腎上腺素較為穩(wěn)定，在pH3.5以下和pH5.5以上腎上腺素的消旋化反應(yīng)速度加快，pH2.5時(shí)制劑中S-對(duì)映體的含量明顯增加，說(shuō)明注射液的pH值過(guò)高或過(guò)低都不利于腎上腺素的穩(wěn)定。

比較7家公司的處方組成與S-對(duì)映體含量的關(guān)系：抗氧劑焦亞硫酸鈉或亞硫酸鈉用量約為0.1%，且添加螯合劑EDTA的產(chǎn)品，各批次S-對(duì)映體含量均<3%；抗氧劑使用量正常，未添加螯合劑EDTA的產(chǎn)品，各批次S-對(duì)映體含量均>3%；抗氧劑使用量?jī)H為0.03%，且添加螯合劑EDTA的A公司產(chǎn)品，各批次S-對(duì)映體含量均>6%。結(jié)果表明抗氧劑焦亞硫酸鈉(或亞硫酸鈉)和螯合劑EDTA有助于注射液中R-對(duì)映體的穩(wěn)定，對(duì)腎上腺素的消旋化有一定的抑制作用。

[1] 宋冬梅，任美婷，段更利.腎上腺素原料藥及鹽酸腎上腺素注射液雜質(zhì)的HPLC-QTOF MS分析[J].藥物分析雜志，2012，32(8)：1468-1470，1452.

[2] 林美新，陳必欽，李忠琴，等.生物轉(zhuǎn)化體系中R腎上腺素光學(xué)純度的測(cè)定[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(4)：395-399.

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[4] 王維庭，賈慶文，莊嚴(yán)，等.毛細(xì)管電泳法拆分腎上腺素手性對(duì)映體[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17(17)：125-127.

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.026

Determination ofS-isomer in Epinephrine Hydrochloride Injection by HPLC with Chiral Mobile Phase Additives

JIN Li, ZHOU Jianli, ZHANG Xiaodan, GU Zhuoliang, BU Ying

(TheInstituteofQualityControlofMedicalMaterialandEquipmentundertheJointLogisticDepartmentofNanjingCommand,Nanjing210002,China)

Objective To establish a method for the chiral separation and determination ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection by HPLC with chiral mobile phase additives. Methods Column of Purospher?STAR RP-18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used.The mobile phase was acetonitrile-10 mmol·L-1sodium dihydrogen phosphate buffer containing 10 mmol·L-1sulfobutylether-β-cyclodextrin (pH adjusted to 3.0 with phosphoric acid) (98.5：1.5), detection wavelength was 280 nm, the flow rate was 0.8 mL·min-1, and the column temperature was 30 ℃. Results Good linear relationship was established between the peak area and the concentration ofS-isomer over the range of 5.02-1501.50 μg·mL-1(R2=0.999 7).The detection limit was 0.05 μg·mL-1. Conclusion The proposed method shows high repeatability and durability.It can be employed for the quality control ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection.

Epinephrine injection, hydrochloride；Chromatography, high performance liquid； Chiral mobile phase； Additives；S-isomer

2014-02-28

2014-07-21

金麗(1976-)，女，江西南昌人，副主任藥師，博士，研究方向：藥物分析。電話：025-80867152-8015，E-mail：mailjinli@sohu.com。

卜瑩(1978-)，女，江蘇揚(yáng)州人，副主任藥師，碩士，研究方向：藥物分析。電話：025-80867169，E-mail：buyouyou@126.com。

R971.3；R927.2

A

1004-0781(2015)06-0799-03