Netrin-1促進(jìn)氧糖剝奪后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活☆

丁喬廖松潔闕嘉麗李晨光余劍

·論 著·

Netrin-1促進(jìn)氧糖剝奪后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活☆

丁喬*廖松潔*闕嘉麗*李晨光*余劍*

目的通過建立體外氧糖剝奪模型模擬缺血缺氧環(huán)境，觀察軸突導(dǎo)向因子netrin-1對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪損傷后的作用。方法體外培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光法檢測其netrin-1受體結(jié)直腸癌缺失基因（deleted in colorectal cancer,DCC）及uncoordinated(UNC)5H2的表達(dá)；并使用不同濃度netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測其細(xì)胞活性。結(jié)果腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)UNC5H2受體，無DCC受體表達(dá)；與對照組相比，濃度為10、50、100 ng/mL的netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞活性增強(qiáng)（10 ng/mL:1.25±0.20,存活率63.33%，P＜0.05;50 ng/mL:1.41±0.17，存活率79.40%，P＜0.05;100 ng/mL:1.33±0.27,存活率75.98%，P＜0.05），且在其濃度為50 ng/mL時(shí)細(xì)胞活性最強(qiáng)。結(jié)論Netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有劑量相關(guān)的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能由其受體UNC5H2介導(dǎo)。

netrin-1氧糖剝奪 血管再生

血管再生是指在已存在的微血管基礎(chǔ)上新生毛細(xì)血管通過內(nèi)皮細(xì)胞出芽的過程[1-2]，已有研究表明在腦梗死等中樞損害后通過促進(jìn)血管再生有助于改善神經(jīng)功能[3-4]。Netrin-1是netrins家族中最受關(guān)注的一種軸突導(dǎo)向因子，在胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中，它依賴其受體UNC5H及DCC通過化學(xué)性吸引或排斥發(fā)揮引導(dǎo)細(xì)胞與軸突遷移的作用[5]。目前越來越多的研究者致力于闡明其在血管再生中的作用[6]，然而，netrin-1對血管再生的作用目前還存在爭議[7]，這可能與局部netrin-1濃度及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的netrin-1受體種類有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬選用與缺血性卒中密切相關(guān)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過建立體外氧糖剝奪[8]模型模擬缺血缺氧環(huán)境，探討不同濃度的netrin-1對氧糖剝奪損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，并初步探索何種受體參與調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat brain microvessel endothelial cells,RBM?VECs）購自美國cell applications公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37°C，5%CO2）培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，80%滿瓶時(shí)傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 RBMVEC的鑒定及RBMVEC上netrin-1受體UNC5H2、DCC的檢測采用VIII因子相關(guān)抗原（von Willebrand factor protein,VWF）鑒定RBM?VEC并檢測其上UNC5H2、DCC受體的表達(dá)。RB?MVEC接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)液，用預(yù)熱至37°C的0.01 MPBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌后，用0.3%TritonX-100破膜10 min，PBS洗滌后，加入正常山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗滌后加入兔抗大鼠VWF（1: 200，Santa Cruz），UNC5H2（1：200，Santa Cruz），

DCC（1:1000，Abcam），同時(shí)用0.01MPBS代替一抗作為陰性對照，濕盒中4°C孵育過夜，PBS洗滌3次后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（1：1000，CST），室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次后用1×hochest 33258避光染核10 min，PBS洗滌2次后于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 氧糖剝奪模型的建立正常培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入DMEM無糖培養(yǎng)液，37°C以4 L/min的流速充以95%N2/5%CO2混合氣體30 min以創(chuàng)建一個(gè)缺氧環(huán)境，維持1 h，正常組細(xì)胞不做任何處理。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性RBMVEC接種于96孔板中，每孔種10000個(gè)細(xì)胞，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后分別加入含netrin-1 10、50、100 ng/mL的DMEM無糖培養(yǎng)基，陰性對照組僅加DMEM無糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后將細(xì)胞置于缺氧環(huán)境，維持1 h，加入CCK-8，37°C孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下比色，計(jì)算相對吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測細(xì)胞活性RBMVEC接種于6孔板，待細(xì)胞生長至80%時(shí)同上述處理，陰性對照組僅加DMEM無糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后將細(xì)胞置于缺氧環(huán)境，維持1 h，用PBS洗滌2次，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，加入1×Annexin V-FITC結(jié)合液300 μL重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC及PI各3 μL，室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），2組比較采用Dunnett檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光正常培養(yǎng)條件下，VWF陽性表明是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記的VWF、UNC5H2蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，無DCC表達(dá)，藍(lán)色為細(xì)胞核（見圖1、2）。

2.2 CCK-8測細(xì)胞活性結(jié)果與僅加培養(yǎng)基的陰性對照組相比，氧糖剝奪（oxygen glucose depriva?tion,OGD）環(huán)境下RBMVEC在培養(yǎng)基中netrin-1濃度為10、50、100 ng/mL時(shí)細(xì)胞活性增強(qiáng)，吸光度分別為1.25±0.20（P＜0.05）、1.41±0.17（P＜0.05）、1.33±0.27（P＜0.05）,其中netrin-1濃度為50 ng/mL時(shí)作用最強(qiáng)（P＜0.05）（如圖3）。

2.3 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測細(xì)胞活性與僅加培養(yǎng)基的陰性對照組相比，OGD環(huán)境下RBMVEC均在培養(yǎng)基中netrin-1濃度為10、50、100 ng/mL時(shí)細(xì)胞活性增強(qiáng)（存活率分別為63.33%、79.40%、75.98%，P＜0.05），其中netrin-1濃度為50 ng/mL時(shí)作用最強(qiáng)（P＜0.05）（圖4）。

圖1 用VWF鑒定RBMVEC A：綠色熒光標(biāo)記的VWF蛋白(箭頭示)B：細(xì)胞核C：融合后。標(biāo)尺=200 μm

圖2 正常RBMVEC表達(dá)UNC5H2情況 A：綠色熒光標(biāo)記的UNC5H2蛋白(箭頭示)B：細(xì)胞核C：融合后。標(biāo)尺=200 μm

圖3 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性吸光度值 *與陰性對照組比較，P＜0.05

圖4 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測細(xì)胞活性 (A:陰性對照組；B:Netrin-1 10 ng/mL；C:Netrin-1 50 ng/mL；D:Netrin-1 100 ng/mL）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞活性增強(qiáng)，濃度為50 ng/mL時(shí)細(xì)胞活性最強(qiáng)，提示netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的劑量相關(guān)的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能由其受體UNC5H2介導(dǎo)。

我們在先前的研究中發(fā)現(xiàn)依賴配體netrin-1的條件性促凋亡受體UNC5H2在腦缺血后遠(yuǎn)隔丘腦部位呈優(yōu)勢表達(dá)[9]，外源性netrin-1蛋白可減輕該部位的細(xì)胞凋亡，并改善神經(jīng)功能，提示netrin-1/ UNC5H2參與腦缺血后的神經(jīng)可塑性過程[10]。Ne?trin-1已被證實(shí)參與血管再生，但目前的研究結(jié)論并不一致[7]。netrin-1刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成，還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞之間的粘附，增強(qiáng)血管對內(nèi)皮生長因子的反應(yīng)，進(jìn)而刺激血管再生，因此有研究者提出netrin-1是一種血管生長因子[11-14]。然而，另有研究表明，netrin-1具有抑制血管生成作用，且此過程必須有UNC5H2受體的參與[15-16]。也有研究提出netrin-1的濃度可能與血管再生有關(guān)，低劑量時(shí)促進(jìn)血管再生，高劑量時(shí)抑制血管再生[17]。這些研究的不同結(jié)論可能與其實(shí)驗(yàn)條件、netrin-1的劑量及netrin-1受體的表達(dá)均有關(guān)系。在本研究條件下，我們發(fā)現(xiàn)netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有劑量相關(guān)的保護(hù)作用，且以50 ng/ mL作用最強(qiáng)。

Netrin-1通過何種受體參與血管再生仍不明確，Wilson等[13]在netrin-1刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成的過程中并未檢測到受體UNC5H2、DCC、neogenin的大量表達(dá)，提示該過程并不依賴于netrin-1的受體；Andrew Nguyen[14]則證實(shí)netrin-1通過依賴受體DCC的ERK1/2-eNOS前饋機(jī)制增加內(nèi)皮細(xì)胞NO量進(jìn)而誘導(dǎo)血管再生。而Lu、Larrivee等[15-16]卻得出通過受體UNC5H2介導(dǎo)的抑制血管生成作用的結(jié)論。本研究僅檢測到腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上有UNC5H2的表達(dá)，而無DCC表達(dá)，提示UNC5H2可能參與netrin-1對氧糖剝奪后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，這還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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R743.3

A

2014-09-01）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.008

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* 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科（廣州 510080）