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    多發(fā)性硬化抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性☆

    2015-02-06 07:59:35姜紅劉廣志周建華楊亭亭向雅娟敖冬慧高旭光
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2015年3期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)抗原硬化

    姜紅劉廣志周建華楊亭亭向雅娟敖冬慧高旭光

    ·短著述·

    多發(fā)性硬化抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性☆

    姜紅*劉廣志*周建華△楊亭亭*向雅娟*敖冬慧*高旭光*

    多發(fā)性硬化CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞白介素轉(zhuǎn)化生長因子

    多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性脫髓鞘疾病,致殘率很高,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1]。其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確,多認(rèn)為由于基因和環(huán)境的相互作用有關(guān)[2]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)MS患者外周血CD4+CD25highTreg的效應(yīng)功能較正常對(duì)照下降[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)靜脈注射給予EAE鼠CD4+CD25+Treg可明顯緩解其臨床病情[4]。獲取足量功能改善的Treg并自體回輸無疑會(huì)為MS治療提供一個(gè)安全有效新途徑。

    既往我們通過體外誘導(dǎo)的方法,以髓鞘堿性蛋白(MBP)85-99肽段作為抗原,以同種異體CD40配體激活的B細(xì)胞為APC,和患者的CD4+CD25-細(xì)胞共培養(yǎng),并以髓鞘堿性蛋白(MBP)85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d,在體外誘導(dǎo)出功能正常的Treg[5],但其機(jī)制尚未明確。因此本文檢測(cè)了體外誘導(dǎo)的Treg和CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中IL-10(白細(xì)胞介素-10)和TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)的表達(dá),以期對(duì)Treg的功能抑制機(jī)制作進(jìn)一步的探討。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 病例收集設(shè)MS組(n=5)和健康對(duì)照組(n=5),全部為北方漢族人,均經(jīng)SSP-PCR方法進(jìn)行HLA-DRBl基因分型后證實(shí)為DR2+。MS入組標(biāo)準(zhǔn):①患者知情同意;②所有MS患者符合2005年McDonald年診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],且均為病情穩(wěn)定的復(fù)發(fā)-緩解型MS。排除標(biāo)準(zhǔn):①入組前6個(gè)月內(nèi)曾接受免疫調(diào)節(jié)藥物治療;②合并有其他自身免疫性疾病。健康對(duì)照經(jīng)檢查均排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其他自身免疫病。B細(xì)胞由同種異體的健康志愿者外周血分離。

    1.2 B細(xì)胞的磁珠分選、體外培養(yǎng)人CD4+初始T細(xì)胞的磁珠分選及鑒定使用B細(xì)胞的磁珠分離試劑盒和CD4+初始T細(xì)胞的磁珠分離試劑盒進(jìn)行,具體操作步驟見[5]。

    1.3 人MBP85-99特異性Treg的誘導(dǎo)、擴(kuò)增及分選將MS患者及健康對(duì)照CD4+初始T細(xì)胞與同種異體B細(xì)胞混合,加入MBP85-99肽段(0.2μg/mL)、可溶性4-1BBL(0.2μg/mL)、雷帕霉素(109 nmol/L)培養(yǎng)10 d,加入抗人CD4(Percp)、CD25(APC)、CD127(FITC)單抗送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部流式細(xì)胞進(jìn)行分選Treg細(xì)胞。具體操作步驟見[5]。

    1.4 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離MS患者及對(duì)照新鮮外周血中單個(gè)核細(xì)胞,每108個(gè)細(xì)胞加入20μL抗人CD4 PerCP、CD25APC McAb各20μL,送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流式分選CD4+CD25-T細(xì)胞。將分選所獲Treg(2x104個(gè)/孔)與自體CFSE標(biāo)記的CD4+CD25-T細(xì)胞按1:1比例共培養(yǎng),同時(shí)加入經(jīng)鈷60(30Gray)照射的自體PBMC 1x105個(gè)/孔,加入含有10%FBS的RP?MI 1640培養(yǎng)液150μL進(jìn)行培養(yǎng)。病例組和對(duì)照組均分為3個(gè)亞組:①陰性對(duì)照:CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg;②MBP組:CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg+MBP85-99肽段;③陽性對(duì)照:CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg+抗-CD3和抗-CD28 McAb,3 d后收集細(xì)胞,取上清液用以檢測(cè)上清液中IL-10和TGF-β1的表達(dá)。由于病例組和對(duì)照組各有1例在培養(yǎng)中出現(xiàn)污染,最終病例組及對(duì)照組均只得到4例的檢測(cè)結(jié)果。

    1.5 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1的表達(dá)使用ELISA試劑盒檢測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)上清里IL-10和TGF-β1的表達(dá),具體操作嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均復(fù)空加樣,取均值進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均值數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本濃度。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)分析分別采用單因素方差分析和T檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 培養(yǎng)上清中IL-10的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=38.01x-1.872。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度,MS組中各亞組IL-10的平均濃度分別為:陰性對(duì)照組(1.58±0.09)pg/mL,MBP組為(2.32±0.12)pg/mL,陽性對(duì)照組為(1.63±0.08)pg/mL。健康對(duì)照組中各亞組IL-10的平均濃度分別為:陰性對(duì)照組

    (1.62±0.12)pg/mL,MBP組為(2.26±0.08)pg/mL,陽性對(duì)照組為(1.62±0.11)pg/mL。MS組和健康對(duì)照組中各亞組比較:陰性對(duì)照組和MBP組比較、陽性對(duì)照組和MBP組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=755.1x+ 89.89。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度,MS組中各亞組TGF-β1的平均濃度分別為:陰性對(duì)照組(168±23)pg/mL,MBP組為(267±49)pg/mL,陽性對(duì)照組為(181±25)pg/mL。健康對(duì)照組中各亞組TGF-β1的平均濃度分別為:陰性對(duì)照組(160±37)pg/mL,MBP組為(249±30)pg/mL,陽性對(duì)照組為(171±30)pg/mL。MS組和健康對(duì)照組中各亞組比較:陰性對(duì)照組和MBP組比較、陽性對(duì)照組和MBP組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    我們的研究發(fā)現(xiàn),以髓鞘堿性蛋白(MBP)85-99肽段作為抗原,以同種異體CD40配體激活的B細(xì)胞為APC,與初始T細(xì)胞共培養(yǎng),并以MBP85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d所誘導(dǎo)的Treg在與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)均可分泌IL-10和TGF-β1,且病例組和對(duì)照組之間無顯著差異,結(jié)合我們既往的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5],進(jìn)一步說明病例組和對(duì)照組所誘導(dǎo)的Treg具有類似的免疫抑制功能,并且通過分泌IL-10和TGF-β1實(shí)現(xiàn)。

    圖1 IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖2 TGF-β1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    TGF-β和IL-10是CD4+CD25+Treg所分泌的主要細(xì)胞因子。TGF-β有6種亞型,其中TGF-β1占90%以上。本研究發(fā)現(xiàn),無論是病例組還是對(duì)照組,各亞組中MBP組TGF-β 1和IL-10的濃度均明顯高于其他亞組,說明該誘導(dǎo)的Treg確為抗原特異性Treg。盡管如此,在以往所作的增殖分析中,MBP亞組的增殖抑制能力僅較其他亞組略強(qiáng)[5],究其原因可能與Treg的其他作用機(jī)制有關(guān)。現(xiàn)多認(rèn)為在抗原濃度低時(shí),CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過細(xì)胞接觸發(fā)揮作用,而在抗原濃度高時(shí)該細(xì)胞同時(shí)通過分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Treg亦可表達(dá)CTLA,CTLA和效應(yīng)T細(xì)胞表面的B7結(jié)合傳遞抑制信號(hào),抑制T細(xì)胞的活化與增殖[7]。對(duì)此今后應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)后Treg上CTLA表達(dá)的檢測(cè)以明確此點(diǎn)。

    Jun等[8]發(fā)現(xiàn),給予實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠尾靜脈注入Treg可減輕病情嚴(yán)重程度,而使用TGF-β抗體中和TGF-β后,Treg的保護(hù)作用則喪失。Ma等[9]研究發(fā)現(xiàn),在獼猴EAE中,總CD4+CD25+Treg和分泌IL-10的I型Treg的數(shù)量和抑制功能在急性期顯著下降,IL-10水平在急性期急劇下降達(dá)9倍之多。醋酸格拉默(GA)是復(fù)發(fā)RRMS治療中的一線用藥,其作用機(jī)制還不清楚。將GA和Treg體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),GA可明顯增加Treg分泌IL-10的水平[10]。以上研究表明,TGF-β和IL-10對(duì)MS具有重要的緩解作用,由于我們所誘導(dǎo)的Treg也可分泌一定水平的TGF-β和IL-10,故給MS患者輸入該細(xì)胞即相當(dāng)于增加了外源性TGF-β和IL-10,可能對(duì)MS具有一定的治療作用。

    目前,Treg已報(bào)道用于I型糖尿病[11]和移植物抗宿主病[12]的治療。上述治療中,Treg均顯示出良好的療效和安全性,但是機(jī)制還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn),多發(fā)性硬化病人體外誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞未存在功能缺陷,且可以通過分泌IL-10和TGF-β1來實(shí)現(xiàn)抑制功能。但是,IL-10和TGF-β1只是Treg發(fā)揮抑制功能的一條途徑,對(duì)Treg發(fā)揮抑制功能的其他機(jī)制如接觸抑制、CD39和CD73的表達(dá)等方面還需要進(jìn)一步研究,才能更好地將體外誘導(dǎo)的抗原特異性Treg用于臨床治療。討論內(nèi)容沒有著重突出本研究的新意。

    [1]張雪彤,李志安,朱昱,等.疲勞、認(rèn)知和情感障礙對(duì)早期多

    發(fā)性硬化患者生存質(zhì)量的影響[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2013,3(10):616-619.

    [2]戴永強(qiáng),李津,伍愛民,等.多發(fā)性硬化與視神經(jīng)脊髓炎患者的HLA-DRB1/DPB1基因多態(tài)性[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2014,40(7):400-404.

    [3]Haas J,Hug A,Viehover A,et al.Reduced suppressive effect of CD4+CD25highregulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with mul?tiple sclerosis[J].Eur J Immunol,2005,35(11):3343-3352.

    [4]Beyersdorf N,Gaupp S,Balbach K,et al.Selective targeting of regulatory T cells with CD28 superagonists allows effective thera?py of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med, 2005,202(3):445-455.

    [5]姜紅,劉廣志,楊亭亭,等.多發(fā)性硬化抗原特異性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體外擴(kuò)增及其功能效應(yīng)[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2014,28(3):466-470.

    [6]Polman C,Reingold S,Edan G,et al.Diagnostic criteria for mul?tiple sclerosis:2005 revisions to the 2001 McDonald criteria[J]. Ann Neurol,2005,58(6):840-846.

    [7]Kataoka H,Takahashi S,Takase K,et a1.CD25+CD4+regulato?ry Tcells exert in vitro suppressive activity independent of CT?LA-4[J].Int Immunol,2005,17(4):421-427

    [8]Jun SM,Ochoa-Repáraz J,Zlotkowska D,et al.Bystander-medi? ated stimulation of proteolipid protein-specific regulatory T (Treg)cells confers protection against experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)via TGF-β[J].Journal of Neuroimmu?nology,2012,245(1-2):39-47.

    [9]Ma A,Xiong Z,Hu Yx,et al.Dysfunction of IL-10-producing type 1 regulatory T cells and CD4+CD25+regulatory T cells in a mimic model of human multiple sclerosis in Cynomolgus monkeys [J].International Immunopharmacology,2009,(9):599-608.

    [10]Putheti P,Soderstrom M,Link H,et al.Effect of glatiramer ace?tate(Copaxone)on CD4+CD25high T regulatory cells and their IL-10 production in multiple sclerosis[J].Journal of Neuroimmu?nology,2003,144(1-2):125-131.

    [11]Thomas HR,Gitelman SE.Altering the course of type 1 diabetes: an update on prevention and new-onset clinical trials[J].Pediatr Diabetes,2013,14(5):311-321.

    [12]Trzonkowski P, Bieniaszewska M, Ju?cińska J, et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127-T regulatory cells[J].Clin Immunol,2009,133(1): 22-26.

    R744.51(

    2014-07-09)

    A(責(zé)任編輯:李立)

    10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.012

    ☆ 國家自然科學(xué)基金(編號(hào):81171123)

    * 北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(北京 100044)

    △北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

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