膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與癇性發(fā)作☆

王新軍楊如意單嶠李培棟吳建珩武躍輝王振

·論 著·

膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達(dá)與癇性發(fā)作☆

王新軍*楊如意*單嶠*李培棟*吳建珩*武躍輝*王振*

目的探討膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者瘤組織中高遷移率族蛋白B1(High-mobility group box-1，HMGB1)的表達(dá)。方法利用免疫組化半定量法檢測(cè)82例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者（膠質(zhì)瘤并癲癇組）膠質(zhì)瘤組織、80例膠質(zhì)瘤不伴發(fā)癲癇的患者（膠質(zhì)瘤非癲癇組）膠質(zhì)瘤組織、80例難治性癲癇患者（非腫瘤癲癇組）致癇灶組織、20例行顱內(nèi)減壓術(shù)患者（陰性對(duì)照組）的正常腦組織中HMGB1的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)組中HMGB1的表達(dá)及其臨床意義。結(jié)果膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1表達(dá)高于膠質(zhì)瘤非癲癇組中膠質(zhì)瘤組織(χ2= 16.944,P＜0.001)，低級(jí)別膠質(zhì)瘤尤甚；高于非腫瘤癲癇組中致癇灶組織(χ2=26.094,P＜0.001)。膠質(zhì)瘤非癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)(χ2=32.273,P＜0.001)、非腫瘤癲癇組致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)(χ2=22.236，P＜0.001)均高于陰性對(duì)照組中正常腦組織。膠質(zhì)瘤并癲癇組中HMGB1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的持續(xù)時(shí)間(r= 0.365,P=0.001)、發(fā)作頻率(r=0.531,P＜0.001)、膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別(r=0.265,P=0.016)呈正相關(guān)。結(jié)論HMGB1在膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，且與癲癇發(fā)作情況關(guān)系密切，膠質(zhì)瘤組織中HMGB1可能與其相關(guān)性癲癇的形成有關(guān)。

HMGB1膠質(zhì)瘤 膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇

高遷移率族蛋白 B1(High-mobility group box-1,HMGB1)最早由Ellerman JE從小牛胸腺中分離得到[1]，是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，其廣泛存在于真核細(xì)胞中。近年來(lái)，科學(xué)家致力于研究HMGB1表達(dá)與腫瘤、癲癇等臨床常見(jiàn)疾病之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在結(jié)腸癌[2]，膠質(zhì)瘤[3]等腫瘤組織中高表達(dá)；另有研究，HMGB1-TLR4通路可能在人類(lèi)原發(fā)性癲癇的發(fā)病和持續(xù)狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)情況，探究膠質(zhì)瘤組織中HMGB1在膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2007年1月1日至2009年12月30日手術(shù)治療的82例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者膠質(zhì)瘤標(biāo)本為膠質(zhì)瘤并癲癇組，同期手術(shù)治療的80例不伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本為膠質(zhì)瘤非癲癇組，80例藥物難治性癲癇患者致癇灶組織標(biāo)本為非腫瘤癲癇組，20例行顱內(nèi)減壓術(shù)的腦組織標(biāo)本為陰性對(duì)照組。研究所需標(biāo)本及患者臨床信息均已獲患者、家屬及我院倫理委員會(huì)同意。

1.2 免疫組化方法標(biāo)本包埋后以3 μm厚連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上。滴加HMGB1單克隆抗體前應(yīng)用微波加熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)液選擇檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）；將切片微波高溫加熱2 min(加熱至微小波動(dòng)，90～95℃）后，立即轉(zhuǎn)為保溫8 min，待降至室溫，用蒸餾水沖洗2次后，置于3%H2O2中8～10 min，再用蒸餾水沖洗2次。滴加HMGB1單克隆抗體4℃過(guò)夜(1：20)，PBS清洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20 min。PBS清洗，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗染色做陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化染色評(píng)估實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化半定量法，HMGB1免疫染色情況參照Wu D[5]等的方法，依據(jù)免疫組化染色率及染色程度綜合評(píng)分得出。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)區(qū)域，高倍視野（×400）觀察5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)HMGB1染色細(xì)胞，染色率=染色細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。無(wú)染色細(xì)胞為0分，染色率≤25%為1分，染色率＞25%～50%為2分，染色率＞50%～75%為3分，染色率＞75%為4分；免疫染色程度依據(jù)細(xì)胞質(zhì)染色深度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分。最后以兩種評(píng)分方式綜合得分為最終得分，我們規(guī)定：陰性（-）：0分，低表達(dá)（+）：1～3分，高表達(dá)（++）：4～6分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行分析。利用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，Spearman秩相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤并癲癇組中癲癇發(fā)病情況、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別與HMGB1表達(dá)的關(guān)系膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)與癲癇持續(xù)時(shí)間(r=0.365，P＜0.001)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.531，P＜0.001)、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.265，P=0.016)正相關(guān)，見(jiàn)表1。

2.2 膠質(zhì)瘤并癲癇組、膠質(zhì)瘤非癲癇組、非腫瘤癲癇組、陰性對(duì)照組中HMGB1的表達(dá)通過(guò)觀察圖1中免疫染色情況及表2中的統(tǒng)計(jì)分析，膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)高于膠質(zhì)瘤非癲癇組中膠質(zhì)瘤組織(χ2=16.944，P＜0.001)，和非腫瘤癲癇組中致癇灶組織(χ2=26.094，P＜0.001)，膠質(zhì)瘤非癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)高于陰性對(duì)照組腦組織(χ2=32.273，P＜0.001)，非腫瘤癲癇組致癇灶組織HMGB1的表達(dá)高于陰性對(duì)照組

腦組織(χ2=22.236，P＜0.001)。

2.3 膠質(zhì)瘤并癲癇組中膠質(zhì)瘤病理級(jí)別對(duì)伴發(fā)癲癇的影響膠質(zhì)瘤并癲癇組中低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤(Low pathological grade glioma,LGG)組織HMGB1表達(dá)高于膠質(zhì)瘤非癲癇組膠質(zhì)瘤組織(χ2=18.360，P＜0.001)，而高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤(High pathological grade glioma,HGG)中HMGB1表達(dá)對(duì)是否伴發(fā)癲癇無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.649，P=0.104)，見(jiàn)表3。

3 討論

圖1 正常腦組織、致癇灶組織、膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的免疫染色（×400,標(biāo)尺=20μm）。A：正常腦組織中HMGB1少量染色；B：非腫瘤癲癇組致癇灶組織中HMGB1的染色；C：膠質(zhì)瘤非癲癇組中低級(jí)別膠質(zhì)瘤（I級(jí)）組織HMGB1的染色；D：膠質(zhì)瘤并癲癇組中低級(jí)別膠質(zhì)瘤（I級(jí)）組織中HMGB1的染色；E：膠質(zhì)瘤非癲癇組中高級(jí)別（IV級(jí)）膠質(zhì)瘤組織中HMGB1表達(dá)；F：膠質(zhì)瘤并癲癇組中高級(jí)別膠質(zhì)瘤（IV級(jí)）組織中HMGB1的染色

表1 膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織HMGB1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[例]

表2 膠質(zhì)瘤并癲癇組、膠質(zhì)瘤非癲癇組、非腫瘤癲癇組、陰性對(duì)照組中HMGB1的表達(dá)[例]

表3 膠質(zhì)瘤組織HMGB1的表達(dá)與不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤是否伴發(fā)癲癇的關(guān)系[例]

癲癇是一種由多種病因引起，可反復(fù)、突然發(fā)作的神經(jīng)功能異常癥候群[4]。其中30%的患者長(zhǎng)期規(guī)范服藥，但仍不能完全控制，即藥物難治性癲癇[6]，對(duì)于難治性癲癇通常采用外科手術(shù)治療[7]。部分難治性癲癇病因明確，如顱內(nèi)腫瘤、硬化，外傷，顱內(nèi)血管畸形等，膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的腫瘤之一[8,9]。

關(guān)于癲癇與HMGB1的研究多著眼于原發(fā)性

癲癇模型中HMGB1表達(dá)，研究表明HMGB1可加重癲癇鼠模型海馬組織損傷，促進(jìn)海馬組織P-gp過(guò)表達(dá)而增加癲癇發(fā)作的易感性[10]，HMGB1在Sombati癲癇細(xì)胞模型中隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加，可能在癲癇的病理生理中起到重要作用[11]。本研究通過(guò)直接檢測(cè)癲癇對(duì)照組患者致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)情況，提示HMGB1的表達(dá)可能與癲癇發(fā)病直接相關(guān)，驗(yàn)證了以往的研究結(jié)論。本研究結(jié)合臨床，可對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)隨訪，探究HMGB1表達(dá)與患者診療、預(yù)后及癲癇控制情況等的關(guān)系，可能為膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的臨床診療提供新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在膠質(zhì)瘤組織中顯著表達(dá)，并且與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別密切相關(guān)[3]。本研究得出類(lèi)似結(jié)論：膠質(zhì)瘤非癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)高于陰性對(duì)照組正常腦組織。不同的是，本研究中膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織HMGB1的表達(dá)高于膠質(zhì)瘤非癲癇組中膠質(zhì)瘤組織。該結(jié)果提示，膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)情況直接影響是否伴癲癇發(fā)病。膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)與癲癇發(fā)作頻率、癲癇持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。研究表明，HMGB1可參與炎癥反應(yīng)而促發(fā)癲癇，抑制炎癥因子及其受體可減少癲癇的發(fā)作頻率、病理?yè)p害程度[12]。該結(jié)果進(jìn)一步提示，膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)對(duì)其是否伴發(fā)癲癇起到重要作用。

本研究將HMGB1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤并癲癇組和膠質(zhì)瘤非癲癇組中的LGG、HGG分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤并癲癇組LGG膠質(zhì)瘤組織的HMGB1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤是否伴發(fā)癲癇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HGG膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)對(duì)其是否伴發(fā)癲癇無(wú)影響，這一結(jié)果由圖1C與圖1D，圖1E與圖1F的比較中不難得出，該結(jié)果提示：HMGB1對(duì)低級(jí)別膠質(zhì)瘤是否伴發(fā)癲癇起到重要作用。該結(jié)果的可能原因：①低級(jí)別膠質(zhì)瘤病程長(zhǎng)，其釋放HMGB1入細(xì)胞外環(huán)境，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，形成瘤周致癇灶，這就是手術(shù)需切除膠質(zhì)瘤及瘤周致癇灶的病理基礎(chǔ)[13]；②膠質(zhì)瘤組織產(chǎn)生大量HMGB1，HMGB1與其受體，如TLR4[4]，RAGE[14]等形成異常放電通路，形成癲癇發(fā)作的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究利用免疫組化法檢測(cè)HMGB1的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇與膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的研究提供新思路。但研究仍具有一定局限性，如未對(duì)膠質(zhì)瘤周?chē)掳B灶及患者血液中HMGB1的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，故尚不能明確HMGB1的具體作用機(jī)制。后期研究中，我們將利用更多的實(shí)驗(yàn)方法，如western-blot,PCR,ELISA等進(jìn)一步檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤周致癇灶組織、血液中HMGB1及其受體的表達(dá)情況，結(jié)合治療后隨訪對(duì)膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇進(jìn)行深入探究。

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Expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy and epileptic seizures

.WANG Xinjun,YANG Ruyi,SHAN Qiao,LI Peidong,WU Jianheng,WU Yuehui,WANG Zhen.Department of Neurosurgery,The Fifth Af?filiated Hospital of Zhengzhou University,No.3 Kang-fu qian Street,Er qi District,Zhengzhou 450052,China.Tel：0371-66916449.

ObjectiveTo explore expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy patients.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of HMGB1 in the tissues from 82 glioma-related epi?lepsy patients(glioma-related epilepsy group),80 glioma patients(glioma without epilepsy group),80 intractable epilepsy patients(epilepsy control group)epileptogenic foci tissue and 20 normal controls(negative control group).ResultsHMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy group was significantly higher than that in glioma tissue of glioma without epilepsy grou p(χ2=16.944,P＜0.001),especially in low pathological grade glioma tissue.HMGB1 was higher in glioma tissue of glioma-related epilepsy group than in epileptogenic foci tissue of epilepsy control group(χ2=26.094,P＜0.001).Expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma without epilepsy group(χ2=32.273,P＜0.001)and epileptogenic foci tissue of epilepsy control group(χ2=22.236，P＜0.001)was higher than in normal brain tissue of negative control group.In glioma-related epilepsy group,HMGB1 was positively correlated with seizures duration(r=0.365，P=0.001),sei?

HMGB1 Glioma tissue Glioma-related epilepsy

R651.1+1

A

2014-10-22）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.006

☆ 河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：092102310090）；鄭州市科技領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（編號(hào)：121PLJRC536）資助

* 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（鄭州450052）

zures frequency(r=0.531，P=0.000)and pathological grade of glioma tissue(r=0.265，P=0.016).ConclusionsHMGB1 is highly expressed in glioma tissues of glioma-related epilepsy;HMGB1 expression is closely related with seizures;and HMGB1 in glioma tissue may contribute to the formation of glioma-related epilepsy.