RP-HPLC測定琥珀酸美托洛爾緩釋片的含量及有關物質(zhì)

陳巖蓓,蔣文玉

(1.桂林市第二人民醫(yī)院藥劑科；2.桂林市精神衛(wèi)生中心藥劑科，廣西 桂林　541001)

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RP-HPLC測定琥珀酸美托洛爾緩釋片的含量及有關物質(zhì)

陳巖蓓1,蔣文玉2

(1.桂林市第二人民醫(yī)院藥劑科；2.桂林市精神衛(wèi)生中心藥劑科，廣西 桂林541001)

摘要：目的 建立琥珀酸美托洛爾緩釋片含量及有關物質(zhì)的RP-HPLC方法。 方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙酸銨緩沖液(3.9 g的乙酸銨溶解于810 mL的水中，加入10.0 mL的冰乙酸，2.0 mL的三乙胺，3.0 mL的磷酸)—乙腈=82 ∶18，流速1.0 mL·min-1，檢測波長275 nm，進樣量10 μL。 結(jié)果琥珀酸美托洛爾在20.00～120.02 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好，檢測限為0.4 ng，定量限為1.2 ng，回收率為100.75%(RSD=0.67%)，測定樣品含量為99.8%，有關物質(zhì)均小于0.2%。結(jié)論該方法快速，簡單，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可作為琥珀酸美托洛爾緩釋片的含量及有關物質(zhì)的檢測方法。

關鍵詞：琥珀酸美托洛爾；HPLC法；含量；有關物質(zhì)

美托洛爾是屬于β1受體阻斷劑，臨床用于高血壓、心絞痛、心律失常[1-2]及伴有左心室收縮功能異常的癥狀穩(wěn)定的慢性心力衰竭。琥珀酸美托洛爾緩釋片(商品名：倍他樂克)由瑞典AstraZeneca研發(fā)生產(chǎn)，含 47.5 mg和95 mg兩個規(guī)格，已經(jīng)在歐盟、北美及我國等多個國家和地區(qū)上市多年，臨床應用廣泛。國內(nèi)市售主要為酒石酸美托洛爾[3-4]，劑型以注射液、片劑為主，其生物利用率低，不良反應較多[5]，琥珀酸美托洛爾能有效避免上述缺點。緩釋片可以有效穩(wěn)定體內(nèi)血藥濃度，增加了藥物的安全性和有效性，減少給藥次數(shù)，避免藥物對胃腸道的刺激。該藥的分子式為(C15H25NO3)2·C4H6O6，分子量652.82，化學名為1-異丙氨基-3-[對-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇琥珀酸鹽。但研究發(fā)現(xiàn)此方法不能將有關物質(zhì)的干擾完全排除。本文通過對現(xiàn)有HPLC的條件進行優(yōu)化，得到快速、準確的測定琥珀酸美托洛爾緩釋片含量及有關物質(zhì)的方法，報道如下。

1儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，紫外檢測器(Agilent)及安捷倫色譜工作站，電子分析天平(AE230S 梅特勒-托利多上海有限公司)，SB5200超聲儀(必能信超聲上海公司)。色譜純乙腈(色譜純，TEDIA公司生產(chǎn))，純化水，乙酸銨(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，三乙胺(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。琥珀酸美托洛爾對照品(英國LGC標準品公司，批號140915-01)，琥珀酸美托洛爾緩釋片(阿斯利康制藥有限公司，批號NI4816，NI4818，NI4822，規(guī)格95 mg)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙酸銨緩沖(3.9 g的乙酸銨溶解于810 mL的水中，加入10.0 mL的乙酸，2.0 mL的三乙胺，3.0 mL的磷酸)—乙腈(82 ∶18)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.2溶液配制

2.2.1含量測定對照品溶液精密稱取琥珀酸美托洛爾對照品80.06 mg，置100 mL容量瓶中，加適量純化水溶解后，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.800 6 g·L-1的對照品溶液，備用。

2.2.2含量測定供試品溶液取供試品琥珀酸美托洛爾緩釋片20片，研細，取細粉適量(約相當于琥珀酸美托洛爾100 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入適量蒸餾水溶解，超聲10 min，放冷，補加蒸餾水至刻度，搖勻，取濾液適量，加蒸餾水制成每1 mL中約含0.8 mg的溶液，備用。

2.2.3有關物質(zhì)測定供試品溶液稱取“2.2.2”項中琥珀酸美托洛爾的研細粉末適量，精密稱定，置于50 mL的容量瓶中，加入適量蒸餾水溶解，超聲10 min，放冷，補加蒸餾水定容，搖勻。配制成每1 mL中含有約100 μg琥珀酸美托洛爾的溶液。

2.2.4有關物質(zhì)對照溶液精密量取“2.2.3”項中的有關物質(zhì)供試品溶液1 mL，置于100 mL的量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻。

2.2.5陰性對照溶液按照處方比例稱取羥丙甲纖維素(hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC )、乙基纖維素(ethyl cellulose，EC)、滑石粉、硬脂酸鎂適量(相當于一片藥物的輔料，不含主藥琥珀酸美托洛爾)，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，超聲10 min，濾過，取適量，稀釋與樣品相同倍數(shù)，即得。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性試驗取“2.2.1”項下琥珀酸美托洛爾對照品溶液1 mL，于10 mL的容量瓶中，加入純化水水定容至刻度，充分振搖溶解，精密量取 10 μL進色譜儀，按照上述色譜條件測定，記錄色譜圖。按照上述方法分別取“2.2.2”項下含量供試品溶液、 “2.2.3”項有關物質(zhì)供試、“2.2.4”項有關物質(zhì)對照及“2.2.5”輔料溶液各1 mL，稀釋至同等濃度，進色譜儀測定，記錄色譜圖，結(jié)果輔料峰未干擾測定,見圖1。

分別取琥珀酸美托洛爾緩釋片適量，研細，精密稱量粉末(約相當于主藥100 mg)進行如下測試：(1)酸破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液25 mL，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉中和并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾;(2)堿破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液25 mL溶解，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1鹽酸中和并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用流動相稀釋，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾;(3)氧化破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加入30%過氧化氫溶液10 mL，搖勻，放置12 h，加水稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾;(4)加熱破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋，配制成濃度0.1 g·L-1的溶液25 mL，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷，過濾;(5)光破壞：將精密成定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋，配置成0.1 g·L-1溶液25 mL，置于強光(5 000 Lx)下照射12 h后，放冷。按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示樣品在經(jīng)過酸、堿、氧化、加熱、光照破壞后主成分與各降解產(chǎn)物可以達到很好的分離,圖2。

2.3.2系統(tǒng)適用性試驗分別精密量取“2.2.1”項中琥珀酸美托洛爾對照品溶液、“2.2.2”琥珀酸美托洛爾緩釋片供試品溶液及“2.2.5”項陰性對照溶液10 μL，按照上述色譜條件進樣，色譜柱的理論塔板數(shù)按照美托洛爾計算不得少于4 000，美托洛爾與相鄰雜質(zhì)峰的分離度不低于2.0。

2.3.3檢測限及定量限測定取“2.2.1”項中配制的琥珀酸美托洛爾的對照品溶液，稀釋至50 mg·L-1，按照上述色譜條件進樣，根據(jù)信噪比法進行試驗，得到的結(jié)果：檢測限為0.4 ng(S/N=3)，定量限為1.2 ng(S/N=10)。

2.3.4線性試驗精密稱量琥珀酸美托洛爾對照品100.02 mg，置于50 mL的容量瓶制備成濃度為2.00 g·L-1的溶液，精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得到濃度依次為20.00，40.01，60.01，80.02，100.02，120.02 mg·L-1濃度的溶液，按照上述色譜條件取10 μL依次進樣，記錄色譜圖。以琥珀酸美托洛爾峰面積Y為縱坐標，以進樣濃度X為橫坐標，得到線性回歸方程為：Y=10 104X+3 281，結(jié)果表明琥珀酸美托洛爾在20.00～120.02 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.5精密度及重復性試驗取“2.2.1”項下琥珀酸美托洛爾對照品溶液，按照上述色譜條件進樣，重復測定6次，記錄美托洛爾的峰面積，計算相標準偏差RSD=0.29%，說明儀器精密度良好。

取NI4816批次的琥珀酸美托洛爾緩釋片6片，分別研細，精密稱量適量的粉末(相當于主藥50 mg)，加水配制成濃度為10 g·L-1供試品溶液6份，按照上述色譜條件在同一高效液相色譜儀上分別進樣，記錄琥珀酸美托洛爾面積，其含量平均值為99.82%，相對標準偏差RSD=0.41%，顯示重現(xiàn)性良好。

2.3.6回收率試驗按照處方比例稱量適量的輔料(相當于1片制劑的輔料量)，分別加入處方量的80%，100%，120%的琥珀酸美托洛爾的對照品，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，每個含量的溶液分別取3份1 mL加流動相稀釋至5 mL作為供試品溶液。精密量取10 μL溶液，按照上述色譜條件進液相儀，記錄圖譜，結(jié)果見表1。計算得平均回收率為100.75%，RSD=0.67%。

表1　加樣回收率數(shù)據(jù)

2.3.7穩(wěn)定性取供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h精密吸取10 μL進樣，記錄色譜圖，根據(jù)琥珀酸美托洛爾峰面積，計算其相對標準偏差RSD為0.45%，說明琥珀酸美托洛爾在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定。

2.4樣品測定

2.4.1有關物質(zhì)測定取上市品琥珀酸美托洛爾緩釋片10片，研細，精密稱量適量粉末(相當于琥珀酸美托洛爾40 mg)，置于100 mL的容量瓶中，加水振蕩溶解，補加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，濾液作為供試品。取“2.2.1”項中琥珀酸美托洛爾對照品溶液稀釋與供試品同等濃度作為對照溶液。精密量取供試品和對照品溶液10 μL進高效液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)面積歸一化法計算有關主峰及有關物質(zhì)的峰面積。按照上述方法分別測定3批上市品(批號NI4816，NI4818，NI4822)中有關物質(zhì)含量分別為0.15%，0.13%，0.16%。

2.4.2含量測定取上市品琥珀酸美托洛爾緩釋片10片，研細，精密稱量適量粉末(約相當于主藥8 mg)，置于100 mL的容量瓶中，加水溶解，補加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品。取“2.2.1”項中琥珀酸美托洛爾對照品溶液稀釋與供試品同等濃度作為對照溶液。精密量取10 μL對照品與供試品溶液，進高效液相色譜儀，記錄圖譜。按照外標法分別測定測定3批上市品(批號NI4816，NI4818，NI4822)中有關物質(zhì)含量分別為99.8%，99.9%，99.8%。

3討論

本研究通過調(diào)整流動相的比例，嘗試使用AlltimaC18、AICHROMEBond C18、HP-35安捷倫 C18柱在分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子等方面綜合考量， ZORBAX SB--C18柱具有能有效分離美托洛爾的有關物質(zhì)C,D，出峰時間合理。另外通過專屬性研究酸、堿、高溫、氧化破壞的雜質(zhì)及對照品最大的吸收峰均在275 nm，此波長可以將主成分及有關物質(zhì)較為靈敏的檢測出。

通過測定的結(jié)果顯示在以下條件：乙酸銨緩沖液(3.9 g的乙酸銨溶解于810 mL的水中，加入10.0 mL的乙酸，2.0 mL的三乙胺，3.0 mL的磷酸)—乙腈(82 ∶18)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃的色譜條件下，主峰和輔料、有關物質(zhì)達到基線分離要求，色譜峰形對稱符合檢測要求。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.016

(收稿日期：2015-09-14，修回日期：2015-09-30)

RP-HPLC determination of metoprolol succinate sustained-release
tablets and its related substances

CHEN Yan-pei1，JIANG Wen-yu2

(1.DepartmentofPharmacy,TheSecondPeople′sHospital;

2.DepartmentofPharmacy,TheMentalHealthCentre,Guilin541001,China)

Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for determination of the content of metoprolol succinate sustained-release tablets and its related substances. Methods The chromatographic separation was performed on ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels, ammonium acetate buffer solution(3.9 g acetic ammonia dissolved in 810 mL water, with an addition of 10.0 mL acetic acid, 2.0 mL triethylamine, 3.0 mL phosphoric acid)- acetonitrile=82 ∶18. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 275 nm. The sample size was 10 μL. Results There is good linearity within the range of 20.00～120.02 mg·L-1. The detection limit was 0.4 ng. The limit of quantitation was 1.2 ng. The average recovery was 100.75% (RSD=0.67%). Determination of the sample average content was 99.8%, and the related substance was less than 0.2%. Conclusion The method is quick, simple, stable and repeatable, which could be used to determine the content of metoprolol succinate sustained-release tablets and its related substances.

Key words：metoprolol succinate sustained-release tablet;HPLC;content;related substance