四種鈣信號蛋白及其在寄生蟲學(xué)上的初步研究

王自文，韓紅玉，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241）

·綜述·

四種鈣信號蛋白及其在寄生蟲學(xué)上的初步研究

王自文，韓紅玉，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241）

不同種類的寄生蟲入侵宿主和入侵后在宿主體內(nèi)生存的機制非常復(fù)雜，但是影響這兩個過程的主要因素目前已逐漸被揭示。Ca2+是寄生蟲體內(nèi)的一種重要的金屬離子，它影響著寄生蟲的許多生理生化活動，如運動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透壓的維持等。而Ca2+信號蛋白則是Ca2+能夠發(fā)揮重要作用的直接承擔(dān)者，鈣離子信號蛋白是直接可以與Ca2+結(jié)合的蛋白質(zhì)，它被Ca2+激活以后又可以與下游和他具有相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使寄生蟲發(fā)揮相應(yīng)的生理生化作用。對能夠與Ca2+信號蛋白結(jié)合的蛋白進(jìn)行研究，有助于研制抗寄生蟲的新藥物和生物制劑，因為它們可能是一種存在于寄生蟲體內(nèi)潛在的新藥物受體和靶標(biāo)，而只有Ca2+信號蛋白被Ca2+活化以后才可以對這一互作蛋白展開深入的研究。本文綜述了在寄生蟲體內(nèi)存在的4種Ca2+信號蛋白的重要性質(zhì)和作用機制，對開展寄生蟲Ca2+信號蛋白及其下游的互作蛋白的研究提供了一個比較基礎(chǔ)的材料。

Ca2+；信號蛋白；鈣調(diào)素；鈣網(wǎng)蛋白；鈣依賴蛋白激酶；膜聯(lián)蛋白

鈣元素廣泛存在于自然界和各種生物體內(nèi)，而游離態(tài)的Ca2+更是在生命活動中扮演著極其重要的角色，它幾乎參與了生命體所有的生理生化活動[1]。作為一種在細(xì)胞內(nèi)以游離狀態(tài)存在的信號分子，Ca2+是細(xì)胞增殖、分裂、運動、能量代謝、氧代謝、細(xì)胞膜通透性及穩(wěn)定性、細(xì)胞的信息傳遞等生理功能正常發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)，胞內(nèi)Ca2+主要來源于胞內(nèi)鈣貯池釋放、電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calcium channel, VDC）及受體介導(dǎo)的胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)的這3個過程[2]。

目前，在人類以及其他哺乳動物中關(guān)于Ca2+的功能及其作用機制已經(jīng)被研究的比較清楚，然而這方面的研究在一些低等生物中還沒有展開。寄生蟲是一種真核生物，無論是寄生在細(xì)胞內(nèi)還是寄生在細(xì)胞外，其入侵和逸出細(xì)胞時，Ca2+都發(fā)揮著重要的作用。然而Ca2+發(fā)揮作用并不是直接進(jìn)行，在一些頂復(fù)器門原蟲當(dāng)中，Ca2+通過結(jié)合下游的一些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類似物，使這些蛋白質(zhì)活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列的級聯(lián)放大反應(yīng)，刺激蟲體的一些細(xì)胞器（如微線體、致密斑和棒狀體）分泌相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而形成帶蟲空泡而入侵或逸出宿主細(xì)胞[3-5]。對于Ca2+在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的信號蛋白質(zhì)即鈣信號蛋白（calcium signaling protein，CSP），目前已經(jīng)在高等生物中有比較清楚的研究，例如鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）、鈣網(wǎng)織蛋白（Calreticulin，CRT）、鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）以及膜聯(lián)蛋白（annexin）等[6]，他們具有很明顯的物種特異性和時期表達(dá)差異性。本文對這4種Ca2+信號蛋白的特性及在寄生蟲學(xué)上的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為深入開展寄生蟲Ca2+信號蛋白的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)材料。

1 鈣調(diào)素（CaM）

1.1 鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)和功能CaM是一種Ca2+受體，其活性受Ca2+調(diào)控。Gehrig等[7]最先對Ca2+-CaM復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，獲得了Ca2+-CaM-TFP的蛋白晶體及由此晶體獲得的部分X光衍射數(shù)據(jù)。隨后，Babu等[8]首次用X光衍射得到大鼠Ca2+-CaM在分辨率為0.13 nm的空間結(jié)構(gòu)，并報道了該蛋白在分辨率為0.122 nm的結(jié)構(gòu)。在分辨率為0.13 nm時，能看到多肽鏈走向，可在一級結(jié)構(gòu)幫助下推測氨基酸種類，但不能分辨氨基酸的側(cè)鏈及多肽鏈的整個構(gòu)象。從該結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)CaM分子為啞鈴形結(jié)構(gòu)，N端及C端為兩個球形結(jié)構(gòu)域，由中央28個氨基酸構(gòu)成的螺旋區(qū)連接，整個分子總長度為615 nm，包括7段α螺旋（α-helix），在N端和C端分別含有2個loop區(qū)，由這4個loop區(qū)與位于兩頭部的6個α-helix共形成4個典型的helix-loop-helix EF手形結(jié)構(gòu)即Ca2+結(jié)合區(qū)，并各結(jié)合1個Ca2+，另外由不相鄰的12個氨基酸殘基分別在N端及C端形成一個loop區(qū)，并與兩個α-helix相連接。在N端和C端的2個Ca2+結(jié)合區(qū)之間分別構(gòu)成1對短的反平行β折疊片（antiparallel beta-sheets），在N端和C端每一半分子中均含有一個疏水穴（hydrophobic cleft），每一疏水穴面積為1.00 nm×1.25 nm，深度0.95 nm，由一級結(jié)構(gòu)不連續(xù)的14個氨基酸殘基構(gòu)成，這兩個疏水穴與中心螺旋共同負(fù)責(zé)與靶酶及拮抗劑結(jié)合[9,10]。眾所周知，生物體內(nèi)的cAMP、cGMP是第二信使，但Ca2+作為信使的作用更大。CaM的主要作用是調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸的代謝水平，CaM通過對磷酸二酯酶（PDE）及腺苷酸環(huán)化酶的作用來調(diào)節(jié)cAMP和cGMP，PDE是第二個已知受CaM激活的酶，它存在于細(xì)胞的顆粒和可溶部分，其功能是分解cAMP及cGMP。CaM調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Ca2+濃度，Ca2+-CaM是膜上鈣泵（Ca2+-Mg2+-ATPase）激活劑。一切細(xì)胞皆由鈣泵維持胞內(nèi)低鈣水平，以防難溶性磷酸鈣鹽形成。CaM調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮以及收縮時的能量供應(yīng)，使供能與收縮協(xié)調(diào)，因此它可很好的調(diào)節(jié)糖原代謝，CaM還調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放以及受精過程、有絲分裂和微管解聚[11]。

1.2 鈣調(diào)素在生物體中的分布以及作用機制CaM廣泛分布于幾乎所有真核生物中，在哺乳動物各種組織以及蛙卵、章魚、海膽卵、蚯蚓、扇貝、?？⒑ｑ?、藻類、霉菌、粘菌、四膜蟲、大麥、小麥、人參、大豆、菠菜中均分離出CaM或者類CaM蛋白[12]。CaM作用機制歸類為2個方面：Ca2+-CaM復(fù)合物直接與下游靶酶結(jié)合，如PDE、磷酸化激酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、環(huán)化酶等，使這些酶活化；通過依賴Ca2+-CaM的蛋白激酶，使靶酶磷酸化產(chǎn)生效應(yīng)，已知依賴CaM的蛋白激酶有磷酸化酶激酶、糖元合成酶激酶、肌球蛋白輕鏈激酶、60 K蛋白激酶、微管蛋白激酶、酪蛋白激酶、髓鞘堿性蛋白激酶、色氨酸單加氧酶激酶、酪氨酸單加氧酶激酶、乙酞膽堿受體激酶等[11]。

1.3 鈣調(diào)素在寄生蟲中所起的作用在錐蟲(Trypanosoma)細(xì)胞活動中，CaM基因是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+代謝的關(guān)鍵基因[13]。而在利什曼原蟲（Leishmania）中，CaM可以有效地對肌球蛋白XXI內(nèi)聚化、運動性以及脂質(zhì)的連接性進(jìn)行調(diào)控，在利什曼原蟲缺乏CaM的情況下，交連肌動蛋白微絲就會形成。交連肌動蛋白微絲是一種不能運動的二聚體，對這種二聚體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)域的頸部包含有1個CaM結(jié)合區(qū)域，這個區(qū)域是肌球蛋白產(chǎn)生力量和運動的關(guān)鍵區(qū)域，也可能是寄生蟲體內(nèi)脂質(zhì)運輸?shù)妮d體，也就是說CaM與此區(qū)域結(jié)合可以防止利什曼原蟲肌球蛋白二聚體的形成[14]。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)CaM在華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）的發(fā)育和生長過程、Ca2+吸收以及營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和蟲卵形成過程中起著重要的作用，且呈現(xiàn)出階段特異性表達(dá)，在華支睪吸蟲的蟲卵階段CaM呈高表達(dá)，免疫化學(xué)熒光定位分析CaM存在于華支睪吸蟲的外被皮、腸道、咽以及蟲卵之中，因此，CaM對于華支睪吸蟲這些器官的形成和功能的正常執(zhí)行具有很大影響。

2 鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）

2.1 鈣網(wǎng)織蛋白的結(jié)構(gòu)和功能CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的一種可溶性Ca2+結(jié)合蛋白，由Ostwald和MacLennan[16]在1974年首次從骨骼肌肌漿網(wǎng)中提純得到。CRT屬KDEL（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號四肽序列）蛋白家族，存在于高等生物除紅細(xì)胞以外所有細(xì)胞中，分子量46 kDa，包含N-、P-、C-3個結(jié)構(gòu)域。在N結(jié)構(gòu)域N末端為高度折疊的球狀結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列最保守；Cys120和Cys146形成二硫鍵，結(jié)合ATP或Zn2+發(fā)生構(gòu)象改變，調(diào)節(jié)CRT與未折疊蛋白的結(jié)合能力；4個His殘基中，His153與CRT功能密切相關(guān)，點突變后抑制InsP3（Inositol 1，4，5-trisphosphate）-Ca2+通道活化[17]。N結(jié)構(gòu)域還與糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合域[18]、α-整合素[19]相互作用，抑制PDI分子伴侶功能，增加ERp57活性；P結(jié)構(gòu)域富含Pro，有A、B兩套重復(fù)序列，對于CRT的Ca2+高親和力和凝集素樣分子伴侶活性非常重要，P結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與其他Ca2+依賴性分子伴侶如鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）、鈣鎂蛋白（Calmegin）等相似，可與PDI及細(xì)胞毒性T細(xì)胞顆粒組分穿孔素（Perforin）相互作用[20]。CRT的C結(jié)構(gòu)域與肌漿網(wǎng)的Ca2+結(jié)合蛋白—集鈣蛋白（Calsequestrin）結(jié)構(gòu)相似，呈強酸性，末端有KDEL序列，可靶向性引導(dǎo)CRT定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，該區(qū)域有較高的Ca2+結(jié)合容量，可調(diào)節(jié)其與PDI、ERp57等分子伴侶的相互作用[16,21]。CRT功能主要有分子伴侶作用[22-24]，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度[25]和影響血管生成[26]。此外，CRT還有參與信號傳導(dǎo)和細(xì)胞粘附，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)生殖細(xì)胞和心臟發(fā)育，抗血栓等功能[27,28]。

2.2 鈣網(wǎng)織蛋白在細(xì)胞中的分布以及作用機制CRT主要存在于真核生物中，在非肌細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，細(xì)胞核和核膜中均發(fā)現(xiàn)，最近研究表明它還存在于細(xì)胞毒性T細(xì)胞胞漿顆粒[20]。Chiran等[29]報道e-CRT通過GPI-錨定結(jié)合分子CD59連接在PMN細(xì)胞表面，補體C1q的膠原尾與e-CRT結(jié)合，影響細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流。CRT作用機制包括4個方面[30]：首先是胞漿定位CRT的轉(zhuǎn)位；其次是磷脂酸絲氨酸外化介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面CRT轉(zhuǎn)位，細(xì)胞表面CRT的轉(zhuǎn)運與胞漿定位的CRT有關(guān)；接下來是細(xì)胞膜表面CRT通過分泌途徑的轉(zhuǎn)位，細(xì)胞膜外CRT可能通過膜泡運輸方式進(jìn)行轉(zhuǎn)位；最后是CRT與伴侶分子共轉(zhuǎn)位。在胞漿定位CRT的轉(zhuǎn)位中，Shaffer等[31]報道，胞漿CRT庫（也稱微庫）沿ER分布，調(diào)節(jié)一系列糖皮質(zhì)激素表達(dá)。Holaska等[32]研究發(fā)現(xiàn)，胞核中的CRT與含有核轉(zhuǎn)運信號（NES）的蛋白發(fā)生相互作用，從而一同被轉(zhuǎn)移至胞漿，該機制稱為“逆向轉(zhuǎn)位”。CRT胞漿定位機制：CRT靶向定位于ER的過程并非十分有效，可能有CRT遺漏在胞漿；CRT定位于ER的信號肽被剪切掉從而失去ER駐留能力[30]。存在于高爾基體中的CRT可能與其伴侶分子（如α-integrin和MHC-I）相關(guān)聯(lián)從而一同轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面[33]。ERp57是CRT轉(zhuǎn)位關(guān)鍵伴隨分子，與CRT有直接相互作用，以shRNA敲除ERp57后，CRT轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面的能力被明顯抑制并失去抗腫瘤作用，外源添加重組CRT蛋白則恢復(fù)該作用[34]。

2.3 鈣網(wǎng)織蛋白在寄生蟲中所起的作用克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi，Tc）分泌的CRT可以抑制宿主的凝集素信號通路，從而逃逸宿主機體本身對蟲體的殺死作用，達(dá)到使蟲體在宿主體內(nèi)能夠幸存的效果。其機制主要是TcCRT可以與宿主的L-Ficolin結(jié)合，使其功能減弱，從而抑制宿主體內(nèi)補體激活的經(jīng)典途徑[35]。盡管寄生蟲與人之間的進(jìn)化距離比較遙遠(yuǎn)，但是寄生蟲的CRT與人類的CRT（HumanCRT，HuCRT）有50%的序列同源性，而在一些關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域中它們的相同性則為80%，對多種寄生蟲CRT的同源性進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，在寄生蟲適應(yīng)自己所處的環(huán)境時CRT都會產(chǎn)生作用，而且這種作用比較保守，在克氏錐蟲與宿主的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生相互作用時，TcCRT能夠抗腫瘤的生長[36]。Debrabant等[37]認(rèn)為利什曼原蟲分泌的蛋白對于它在所要寄生的媒介昆蟲和哺乳動物宿主細(xì)胞中的生存至關(guān)重要，然而CRT對于利什曼原蟲分泌這些相關(guān)蛋白質(zhì)具有很大的影響，同時CRT也決定著利什曼原蟲自身的毒力強弱。

3 鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）

3.1 鈣依賴蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能CDPKs是鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶或類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶（calmodulin-like domain protein kinases），由多基因編碼的大家族。擬南芥基因組有34個CDPKs基因，水稻基因組有29個CDPKs基因[38]。CDPKs為單肽鏈，具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，從N端到C端有4個功能區(qū)，依次是可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)[39]。N末端的可變區(qū)長短不一，很少有同源性；催化區(qū)有典型的Ser/Thr蛋白激酶催化保守序列；同源性較高連接區(qū)在各類功能區(qū)中最保守，富含堿性氨基酸，緊靠催化區(qū)以擬底物方式與催化區(qū)結(jié)合起自抑制作用，所以該區(qū)又稱自抑制區(qū)；調(diào)控區(qū)是鈣結(jié)合區(qū)，也是CDPKs有別于其它類型激酶的特有區(qū)域，保守性最差，調(diào)控區(qū)有一段結(jié)構(gòu)和功能類似于CaM的氨基酸序列，一般共有4個與Ca2+結(jié)合的EF手性結(jié)構(gòu)，這是CDPKs對Ca2+高度親和而不依賴于CaM的原因[38]。認(rèn)識CDPKs底物可推知其功能，迄今發(fā)現(xiàn)的CDPKs底物包括代謝酶類（如蔗糖合成酶、PEP梭化酶、亞硝酸還原酶等）、脅迫相關(guān)蛋白（如PAL）、抗菌蛋白（如馬鈴薯梭膚酶抑制劑、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、植保素等）、離子通道蛋白（如ACAZ、KATl、H+-ATpase等）、其他蛋白（如熱穩(wěn)定蛋白）等[40]。真菌激發(fā)子可引起質(zhì)膜H+-ATPase磷酸化狀態(tài)改變，接種真菌激發(fā)子2 h后，發(fā)現(xiàn)脫磷酸化的H+-ATPase被CDPK重新磷酸化[40]。許多離子的運輸受CDPK調(diào)節(jié)，如質(zhì)膜H+-ATPase[41,42]、磷酸肌醇4激酶[43]、質(zhì)膜內(nèi)向K+通道等[44-45]。

3.2 鈣依賴蛋白激酶在生物體中的分布以及作用機制CDPKs存在于植物[46]、綠藻[47]，且在植物體內(nèi)分布廣泛，但在細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲和脊椎動物中尚未發(fā)現(xiàn)[48]。CDPKs通過對Ca2+信號傳遞過程的下游蛋白磷酸化而產(chǎn)生磷酸化級聯(lián)放大效應(yīng)，就是通過這種不斷向下游傳遞的磷酸化信號，使相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。Ca2+與CDPKs結(jié)合以后，CDPKs被激活從而與其下游的特異性底物結(jié)合，底物磷酸化刺激亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分泌一些蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)逸出細(xì)胞后發(fā)揮作用。同時CDPKs本身也存在磷酸化位點，在許多CDPKs中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)自磷酸化現(xiàn)象的存在，CDPKs活性除了受Ca2+和磷酸化調(diào)節(jié)，還受14-3-3蛋白、脂類等物質(zhì)的調(diào)節(jié)[38]。

3.3 鈣依賴蛋白激酶在寄生蟲中所起的作用作為Ca2+信號蛋白的CDPKs向下游所傳遞的信號在頂復(fù)門寄生蟲中具有多重作用。在剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tg）中，TgCDPKs家族的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)蟲體頂部微線體蛋白質(zhì)的分泌，而這種蛋白在剛地弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時是必需的[49,50]。在惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）中，通過序列比對發(fā)現(xiàn)PfCDPKs家族有7個CDPK基因，PfCDPK1具有促進(jìn)惡性瘧原蟲的運動性和入侵細(xì)胞的作用，并且PfCDPK1對于惡性瘧原蟲在宿主血液中的發(fā)育也極其重要，而Ca2+對惡性瘧原蟲的配子發(fā)育過程有直接影響，PfCDPK3和PfCDPK4是Ca2+在惡性瘧原蟲配子發(fā)育過程的中介，PfCDPK5參與了惡性瘧原蟲從紅細(xì)胞逸出的過程[51]。在柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella, Et）中，用Real-time quantitative PCR檢測EtCDPK3基因的表達(dá)，結(jié)果表明在柔嫩艾美耳球蟲的子孢子階段EtCDPK3基因高表達(dá)，子孢子階段是柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞最主要的一個階段，因此EtCDPK3蛋白對于蟲體入侵和逸出宿主細(xì)胞具有推動作用[52]?？傊?，CDPKs家族的蛋白質(zhì)能夠影響頂復(fù)門原蟲一系列的生理生化活動，促進(jìn)頂復(fù)門原蟲致密斑、微線、棒狀體蛋白的分泌，使蟲體的運動性加強，入侵宿主細(xì)胞能力增強，從而更加適應(yīng)宿主細(xì)胞的環(huán)境[53]。

4 膜聯(lián)蛋白（Annexin）

4.1 膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能Annexin是一類依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白家族，Annexin最早發(fā)現(xiàn)于1978年，由Creutz等[54]分離純化。從第一個被克隆的人AnnexinA1和A2以來，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過103個Annexin亞家族成員，這些Annexin分布在動植物各種組織和細(xì)胞中[55]。Annexin在進(jìn)化上較保守，多數(shù)Annexin是胞內(nèi)蛋白。Annexin在胞內(nèi)以游離形式存在，也可與細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架結(jié)合[56-58]。Annexin具備與Ca2+結(jié)合的能力，因此Annexin能參與一系列依賴于Ca2+的生物學(xué)活動[59]。依照基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及染色體上的定位不同，Annexin 分5類：A類為脊椎動物Annexin、B類為無脊椎動物Annexin、C類為真菌和單細(xì)胞真核生物Annexin、D類為植物Annexin、E類為原生生物Annexin[60]。Annexin家族由超過500種基因編碼，其蛋白結(jié)構(gòu)具有極高相似性，每個Annexin含2個主要區(qū)：多樣的N端和保守的C端，保守C端一般有4個Annexin重復(fù)序列（AnnexinA6含有8個），每個重復(fù)序列由大約70個高度保守的氨基酸殘基構(gòu)成，每一重復(fù)序列形成由5個α-helix堆疊成的致密圓盤狀，該結(jié)構(gòu)域有結(jié)合Ca2+的能力，是Annexins家族成員的核心區(qū)域，與Ca2+結(jié)合后，此結(jié)構(gòu)域再與帶負(fù)電荷的磷脂分子極性頭部結(jié)合；N端結(jié)構(gòu)域也稱尾區(qū)，包括蛋白水解位點、磷酸化位點和其他蛋白結(jié)合位點，是Annexins分子的功能調(diào)節(jié)區(qū)[61,62]。作為一種膜磷脂結(jié)合蛋白，Annexin參與了與生物膜結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的多種生命活動，如生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、吞噬囊泡形成、Ca2+代謝及其離子轉(zhuǎn)運，并與細(xì)胞骨架相互作用參與細(xì)胞的有絲分裂[63]。Annexin參與細(xì)胞膜之間緊密連接的形成[64]，X射線晶體學(xué)、電泳分析和同源模建結(jié)果表明，某些Annexin直接作用于Ca2+通道，特別是Annexin I、Annexin V、Annexin VI 和Annexin VII都參與細(xì)胞電壓門控Ca2+通道的活動[65]。

4.2 膜聯(lián)蛋白在生物體中的分布以及作用機制Annexin在自然界分布廣泛，無論是脊椎動物還是無脊椎動物、植物、真菌和單細(xì)胞真核生物、原生動物中均有發(fā)現(xiàn)。Annexin的作用機制是當(dāng)Annexin與Ca2+結(jié)合后，N端結(jié)構(gòu)會改變，這種改變使Annexin能與一種叫做S100A10的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，2個Annexin-S100A10蛋白復(fù)合體結(jié)合形成異四聚體蛋白，憑借這種結(jié)合作用使細(xì)胞膜之間的距離不斷被拉近，膜脂相互融合形成囊泡[66,67]。隨后Annexin磷酸化，導(dǎo)致Annexin的N端區(qū)域非常容易受到蛋白水解酶攻擊, 蛋白水解釋放S100A10二聚體，細(xì)胞膜裂解，囊泡被釋放出來[68]。

4.3 膜聯(lián)蛋白在寄生蟲中所起的作用Annexin家族成員目前只有很少一部分被研究清楚。利什曼原蟲的前鞭毛體中缺乏磷脂酰絲氨酸，但它前鞭毛體的AnnexinⅤ可結(jié)合磷脂酸，功能等效于磷脂酰絲氨酸，因此利什曼原蟲的前鞭毛體能發(fā)揮正常作用[69]。Annexin B30是華支睪吸蟲的一種分泌性蛋白質(zhì)，對Annexin B30的研究有助于了解華支睪吸蟲的致病機制。目前CsANXB30已被分離出來，Real-time PCR表明CsANXB30在華支睪吸蟲囊蚴階段高表達(dá)，CsANXB30一般存在于蟲體外表皮、腸道和成蟲卵以及囊蚴表皮和卵黃腺中，其Ca2+結(jié)合部位一旦與Ca2+結(jié)合就會具有結(jié)合磷脂的能力。He等[70]稱Annexin B30參與蟲體與宿主間的相互作用并且能影響被感染宿主的自身免疫反應(yīng)，在體外發(fā)現(xiàn)牛血吸蟲（Schistosoma bovis）的Annexins具有溶解纖維蛋白和作為抗凝劑的作用，曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）的Annexin 2參與外表皮全部發(fā)育過程。Borges等[71]稱在間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）中Annexin-A1能夠調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答。Hongsrichan等[72]稱在麝貓后睪吸蟲（Opisthorchis viverrini）中分泌的Annexin A1 （ANXA1）具有控制抗炎癥信號釋放，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中激酶的活化，自身細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)完整性的維持，組織發(fā)育和細(xì)胞凋亡以及變異的能力，所以ANXA1在蟲體與宿主動態(tài)相互作用中起紐帶作用。因此，Annexin家族成員對寄生蟲生理生化活動具有很大的影響。寄生蟲Annexin不僅參與了維持其自身細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，而且能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而為自己營造一個適宜的生存壞境，同時Annexin也是一個今后抗寄生蟲藥物研究的新靶標(biāo)[73,74]。

5 展望

Ca2+對于生物體的生命活動至關(guān)重要，它與生命體的新陳代謝活動息息相關(guān)，然而隱藏在Ca2+背后的鈣信號蛋白則是Ca2+能夠正常發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，所以對于Ca2+信號蛋白的認(rèn)識是更進(jìn)一步去了解Ca2+功能的有效途徑。對于寄生蟲來說，鈣信號蛋白能夠有助于它進(jìn)入宿主和入侵宿主細(xì)胞，如果有一種理想的Ca2+阻斷劑，則可以有效地控制寄生蟲病，但這是不現(xiàn)實的。因此，可以把控制寄生蟲病的研究方向聚焦在Ca2+下游的鈣信號蛋白上。如鈣依賴蛋白激酶，它僅僅存在于頂復(fù)門原蟲和植物中，在其他的哺乳動物中沒有發(fā)現(xiàn)。在弓形蟲和瘧原蟲中對于鈣依賴蛋白激酶的研究已經(jīng)很成熟了，而在球蟲上這方面的研究還不是很多，由于這一激酶天然的特異性和獨特的功能，它可能成為一個較好的藥物結(jié)合或者阻斷的靶標(biāo)，將為球蟲病的防治研究提供新的方向。

對于蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)目前已經(jīng)很成熟，如酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）、GST Pull-down技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、Far-western技術(shù)等，運用這些技術(shù)可以準(zhǔn)確的篩選和分離出與寄生蟲相關(guān)的Ca2+信號蛋白的下游作用底物或者相關(guān)的結(jié)合因子，對這些底物或者相關(guān)因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究，只要破壞底物的結(jié)構(gòu)就可以達(dá)到阻斷整個鈣信號蛋白介導(dǎo)的入侵信號通路，間接的通過阻斷鈣信號蛋白的功能來抑制寄生蟲對宿主的入侵或者逃逸過程，從而降低寄生蟲病的發(fā)生概率，所以寄生蟲的Ca2+信號蛋白是研制新型抗寄生蟲藥物和生物制劑的良好靶標(biāo)和潛在位點。

[1] Berridge M J, Lipp P, Bootman M D.The versatility and universality of calcium signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2000, 1(1)∶ 11-21.

[2] 黃俊, 梁志民.細(xì)胞內(nèi)Ca2+研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)文選, 2000, 19(5)∶ 790-791.

[3] Dubremetz J F, Garcra-reguet N, Fourmaux M N, et al.Apical organelles and host cell invasion by Apicomplexa[J].Int J Parasitol, 1998, 28(7)∶ 1007-1013.

[4] Etzold M, Lendner M, Daugschies A, et al.CDPKs of Cryptosporidium parvum—stage-specific expression in vitro[J].Parasitol Res, 2014, 113(7)∶ 2525-2533.

[5] 韓紅玉, 林矯矯, 黃兵.雞球蟲入侵相關(guān)分子的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(9)∶ 60-64.

[6] 張娜, 尚忠林.植物細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白(annexin)[J].植物生理學(xué)通訊, 2010, 46(3)∶ 277-283.

[7] Gehrig L M, Delbaere L T, Hickie R A.Preliminary X-ray data for the calmodulin/trifluoperazine complex[J].J Mol Biol, 1984, 177(3)∶ 559-561.

[8] Babu Y S, Sack J S, Greenhough J J, et al.Threedemensional structure of calmodulin[J].Nature, 1985, 315(6014)∶ 37-40.

[9] Zielinski R E.Calmodulin and calmodulin-binding proteins in plants[J].Annu Rev Plant Biol, 1998, 49(1)∶697-725.

[10] Reddy A S N, Day I S, Narasimhulu S B, et al.Isolation and characterization of a novel calmodulin-binding protein from potato[J].J Biol Chem, 2002, 277(6)∶ 4206-4214.

[11] 顧永清.鈣調(diào)素的生理功能[J].生物學(xué)通報, 1994, 29(10)∶12-14轉(zhuǎn)17.

[12] 陳龍.鈣調(diào)素的分布與功能[J].周口師專學(xué)報, 1994, 11(1)∶55-58轉(zhuǎn)72.

[13] Miranda A, Samudio F, Salda?a A, et al.The calmodulin intergenic spacer as molecular target for characterization of Leishmania species[J].Parasit Vectors, 2014, 7(35)∶1-9.

[14] Batters C, Ellrich H, Helbig C, et al.Calmodulin regulates dimerization, motility,and lipid binding of Leishmania myosin XXI[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(2)∶E227-E236.

[15] Zhou J, Sun J, Huang Y, et al.Molecular identification, immunolocalization, and characterization of Clonorchis sinensis calmodulin[J].Parasitol Res, 2013, 112(4)∶1709-1717.

[16] 徐菲菲, 劉秀華.鈣網(wǎng)蛋白的生理及病理生理學(xué)作用[J].生理科學(xué)進(jìn)展, 2006, 37(3)∶ 216-220.

[17] Guo L, Groenedyk J, Papp S, et al.Indentification of an N-domain histidine essential for chaperone function in calreticulin[J].J Biol Chem, 2003, 278(50), 50645-50653.

[18] Michalak M, Burns K, Andrin C, et al.Endoplasmi creticulum form of calreticulin modulates glucocorticoidsensitive gene expression[J].J Biol Chem, 1996, 271(46), 29436-29445.

[19] Coppolino M G, Woodside M J, Dem aurex N, et al.Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion[J].Nature, 1997, 386(6627)∶843-847.

[20] Andrin C, Pinkoski M J, Burns K, et al.Interaction between a Ca2+-binding protein calreticulin and perforin, a component of the cytotoic T-cell granules[J].Biochemistry, 1998, 37(29), 10386-10394

[21] 夏燕, 王艷林.鈣網(wǎng)蛋白的生物學(xué)特點及在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥, 2012, 52(23)∶ 85-86轉(zhuǎn)89.

[22] Helenius A, Aebi M.Role of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum[J].Annu Rev Biochem, 2004, 73(1)∶ 1019-1049.

[23] Yoshiro S, Yoshito I.Calreticulin functions in vitro as a molecular chaperone for both glycosylated and nonglycosylated proteins[J].EMBO J, 1999, 18(23)∶ 6718-6729.

[24] Stevens F J, Argon Y.Protein folding in the ER[J].Semin Cell Dev Biol, 1999, 10(5)∶ 443-454.

[25] Wen X, Frank J L, Mary R W, et al.CRT modulates capacitative Ca2+influx by controlling the extent of inositol 1, 4, 5-Trisphosphate- induced Ca2+store depletion[J].J Biol Chem, 2000, 275(47)∶ 36676-36682.

[26] Yao L, Pike S E, Tosato G, et al.Laminin binding to the calreticulin fragment vasostatin regulates endothelial cell function[J].J Leukoc Biol, 2002, 71(1)∶ 47-53.

[27] 湯曉燕.鈣網(wǎng)蛋白的生物學(xué)功能及其與自身免疫疾病的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊), 2005, 28(4)∶ 230-233.

[28] Steven J, Marek M, Michal O, et al.The ins and outs of Calreticulin∶ from the ER lumen to the extrcellular space[J].Trends Cell Biol, 2001, 11(3)∶ 122-129.

[29] Ghiran I, Klickstein L B, Nicholson-Weller A.Calreticulin is at the surface of circulating neutrophils and uses CD59 as an adaptor molecule[J].J Biol Chem, 2003, 278(23), 21024-21031.

[30] Jalali S, Aghasi M, Yeganeh B, et al.Calreticulin regulates insulin receptor expression and its downstream PI3 kinase/akt signalling pathway[J].Biochim Biophys Acta, 2008, 1783(12), 2344-2351.

[31] Shaffer K L, Sharma A, Snapp E L, et al.Regulation of protein compartmentalization expands the diversity of protein function[J].Dev Cell, 2005, 9(4)∶ 545-554.

[32] Holaska J M, Black B E, Love D C, et al.Calreticulin is a receptor for nuclear export[J].J Cell Biol, 2001, 152(1)∶127-140.

[33] 王曉礽, 劉秀華.非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣網(wǎng)蛋白的生物學(xué)作用及其機制[J].生理科學(xué)進(jìn)展, 2012, 43(1)∶ 29-33.

[34] Tufi R, Panaretakis T, Bianchi K, et al.Reduction of endoplasmic reticulum Ca2+levels favors plasma membrane surface exposure of calreticulin[J].Cell Death Differ, 2007, 15(2)∶ 274-282.

[35] Sosoniuk E, Vallejos G, Kenawy H, et al.Trypanosoma cruzi calreticulin inhibits the complement lectin pathway activation by direct interaction with l-Ficolin[J].Mol Immunol, 2014, 65(1)∶ 80-85.

[36] Ferreira V, Molina M C, Valck C, et al.Role of calreticulin from parasites in its interaction with vertebrate hosts[J].Mol Immunol, 2004, 40(17)∶ 1279-1291.

[37] Debrabant A, Lee N, Pogue G P, et al.Expression of calreticulin P-domain results in impairment of secretory pathway in Leishmania donovani and reduced parasite survival in macrophages[J].Int J Parasitol, 2002, 32(11)∶1423-1434.

[38] 萬丙良.水稻CDPKs基因的表達(dá)及其功能研究[D].武漢∶華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[39] Harper J F, Sussman M R, Schaller G E, et al.A calciumdependent protein kinase with regulatory domain similar to calmodium[J].Science, 1991, 252(5008)∶ 951-954.

[40] Xing T, Higgins V J, Blumwald E.Regulation of plant defense response to fungal pathogens∶ two types of protein kinase in the reversible phosphorylation of the host plasma membrane H+-ATPase[J].Plant Cell, 1996, 8(3)∶ 555-564.

[41] Camoni L, FulloneM R, Marra M, et al.The plasma membrane H+-ATPase frommaize roots is phosphorylated in the C- terminal domain by a calcium-dependent protein kinase[J].Physiol Plant, 1998, 104(4)∶ 549-555.

[42] Schaller G E, Sussman M R.Phosphorylation of the plasma-membrane H+-ATPase of oat roots by a calciumstimulated protein kinase[J].Planta, 1988, 173(4)∶ 509-518.

[43] Yang W, Boss W F.Regulation of phosphatidylinositol 4-kinase by the protein activator PIK-A49[J].J Biol Chem, 1994, 269(5)∶ 3852-3857.

[44] 陳碩, 陳珈.植物中鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)的結(jié)構(gòu)與功能[J].植物學(xué)通報, 2001, 18(2)∶ 143-148.

[45] Li J, Lee Y R, Assmann S M.Guard cells possess a calcium-dependent protein kinase that phosphorylatesthe KAT1 potassium channel[J].Plant Physiol, 1998, 116(2)∶785-795.

[46] Roberts D M, Harmon A C.Calcium-modulated proteins∶targets of intracellular calcium signals in higher plants[J].Annu Rev Plant Biol, 1992, 43(1)∶ 375-414.

[47] Yuasa T, Muto S.Ca2+-dependent protein kinase from the halotolerant green alga dunaliella tertiolecta∶ partial purification and Ca2+-dependent association of the enzyme to the microsomes[J].Arch Biochem Biophys, 1992, 296(1)∶ 175-182.

[48] 暢文君.番茄鈣依賴性蛋白激酶的生化鑒定和功能分析[D].?？凇?海南大學(xué), 2010.

[49] 陶青, 趙俊龍.鈣離子信號通路及相關(guān)蛋白激酶對弓形蟲的作用[J].中國人獸共患病學(xué)報, 2011, 27(11)∶ 1041-1043.

[50] Nagamune K, Beatty W L, Sibley L D.Artemisinin induces calcium-dependent protein secretion in the protozoan parasite Toxoplasma gondii[J].Eukaryot Cell, 2007, 6(11)∶ 2147-2156.

[51] Lauciello L, Kappes B, Scapozza L, et al.Expression, purification and biochemical characterization of recombinant Ca-dependent protein kinase 2 of the malaria parasite Plasmodium falciparum[J].Protein Expr Purif, 2013, 90(2)∶ 170-177.

[52] Han H Y, Zhu S H, Jiang L L, et al.Molecular characterization and analysis of a novel calciumdependent protein kinase from Eimeria tenella[J].Parasitology, 2013, 140(6)∶ 746-755.

[53] Billker O, Lourido S, Sibley L D.Calcium-dependent signaling and kinases in apicomplexan parasites[J].Cell Host Microbe, 2009, 5(6)∶ 612-622.

[54] Creutz C E, Pazoles C, Pollard H B.Identification and purification of an adrenal medullary protein(synexin) that causes calcium-dependent aggregation of isolated chromaffin granules[J].J Biol Chem, 1978, 253(8)∶ 2858-2866.

[55] Huang K S, Wallner B P, Mattaliano R J, et al.Two human 35kD inhibitors of phospholipase A2 are related to substrates of pp60v-srcand of the epidermal growth factor receptor/kinase[J].Cell, 1986, 46(2)∶ 191-199.

[56] Mortimer J C, Laohavisit A, Macpherson N, et al.Annexins∶ multifunctional components of growth and adaptation[J].J Exp Bot, 2008, 59(3)∶ 533-544.

[57] Chander A, Chen X L, Naidu D G.A role for diacylglycerol in annexin A7-mediated fusion of lung lamellar bodies[J].Biochim Biophys Acta, 2007, 1771(10)∶ 1308-1318.

[58] Hofmann A.Annexins in the plant kingdom∶ perspective and potentials[J].Annexins, 2004, 1(1)∶ 51-61.

[59] 黃逸群, 左開井.膜聯(lián)蛋白的功能與調(diào)控研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展, 2012, 2(3)∶ 157-164.

[60] Moss S E, Morgan R O.The annexins[J].Genome Biol, 2004, 5(4)∶ 1-8.

[61] Gerke V, Moss S E.Annexins∶ from structure to function[J].Physiol Rev, 2002, 82(2)∶ 331-371.

[62] Seaton B A, Dedman J R.Annexins[J].Biometals, 1998, 11(4)∶ 399-404.

[63] Rescher U, Gerke V.Annexins-unique membrane binding proteins with diverse functions[J].J Cell Sci, 2004, 117(13)∶ 2631-2639.

[64] Lee S M, Lee E J, Yang E J, et al.Identification of annexins, calcium-dependent membrane binding proteins that mediate osmotic stress and abscisic acid signal transduction in Arabidopsis[J].Plant Cell, 2004, 16(6)∶1378-1391.

[65] Pollard H B, Guy H R, Arispe N, et al.Calcium channel and membrane fusion activity of synexin and other membranes of annexin gene family[J].Biophys J, 1992,62(1)∶ 15-18.

[66] Bevers E M, Janssen M P, Willems G M, et al.No evidence for enhanced thrombin formation through displacement of annexin V by antiphospholipid antibodie[J].J Thromb Haemost, 2000, 83(5)∶ 792-794.

[67] Rety S, Sopkova J, Renouard M, et al.The crystal structure of a complex of p11 with the annexin II N-terminal peptide[J].Nat Struct Biol, 1999, 6(1)∶ 89-95.

[68] Futter C E, Felder S, Schlessinger J, et al.Annexin I is phosphorylated in the multivesicular body during the processing of the epidermal growth factor receptor[J].J Cell Biol, 1993, 120(1)∶ 77-83.

[69] Weing?rtner A, Kemmer G, Müller F D, et al.Leishmania promastigotes lack phosphatidylserine but bind annexin V upon permeabilization or miltefosine treatment[J].PloS One, 2012, 7(8)∶ e42070.

[70] He L, Ren M, Chen X, et al.Biochemical and immunological characterization of annexin B30 from Clonorchis sinensis excretory/secretory products[J].Parasitol Res, 2014, 113(7)∶ 2743-2755.

[71] Borges Q I, Fontes C J, Damazo A S.Analysis of lymphocytes in patients with Plasmodium vivax malaria and its relation to the annexin-A1 and IL-10[J].Malar J, 2013, 12(455)∶ 1-7.

[72] Hongsrichan N, Intuyod K, Pinlaor P, et al.Cytokine/ Chemokine secretion and proteomic identification of upregulated annexin A1 from peripheral blood mononuclear cells cocultured with the liver fluke Opisthorchis viverrini[J].Infect Immun, 2014, 82(5)∶2135-2147.

[73] Cantacessi C, Seddon J M, Miller T L, et al.A genomewide analysis of annexins from parasitic organisms and their vectors[J].Sci Rep, 2013, 3∶ 2893.

[74] Jenikova G, Hruz P, Andersson M K, et al.α1-giardin based live heterologous vaccine protects against Giardia lamblia infection in a murine model[J].Vaccine, 2011, 29(51)∶ 9529-9537.

FOUR CALCIUM SIGNALING PROTEINS AND THEIR PRELIMINARY STUDIES IN PARASITOLOGY

WANG Zi-wen, HAN Hong-yu, HUANG Bing

(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The invasion of a variety of parasites to hosts and their survival mechanisms in hosts are extremely complicated.However, the main elements that have an impact on these two processes have been revealed gradually.Calcium ion is a kind of important metal ions in parasites and infl uences a lot of physiological and biochemical activities, such as sports, signal transduction and osmotic pressure maintenance.Calcium ion signaling protein plays a key role by directly binding with calcium ion and interacting with other proteins on the downstream.As a result, a series of physiological and biochemical effects occur in parasites.Because the interaction proteins with calcium ion signaling protein may be the potential new drug receptors and targets, the research of the interaction proteins with calcium ion signaling protein will be of help to develop new drugs and biologics against parasites.However, we cannot further investigate the interaction proteins with calcium ion signaling protein until calcium ion activates calcium ion signaling protein.This paper reviews the important properties and action mechanisms of four calcium ion signaling proteins that exist in parasites and will provide useful information on future studies.

Ca2+; signal protein; calmodulin; calreticulin; calcium-dependent protein kinases; annexin

S852.7

A

1674-6422（2015）02-0078-09

2014-12-16

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2014JB03）

王自文，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

韓紅玉，E-mail∶ hhysh@shvri.ac.cn；黃兵，E-mail∶ hb@shvri.ac.cn