鈦顆粒對OPG-RANKL-RANK 通路干預(yù)的時間依賴性研究

吳 垠 王 楊 勾旭升 劉立冰 趙承斌

近年來，人工髖關(guān)節(jié)置換已經(jīng)成為關(guān)節(jié)外科的常規(guī)手術(shù)，隨著人工關(guān)節(jié)置換例數(shù)的增加及術(shù)后假體使用時間的延長，假體周圍骨溶解及人工關(guān)節(jié)的無菌性松動成為關(guān)節(jié)外科面臨的難題之一。關(guān)節(jié)翻修術(shù)是目前解決假體松動的主要方法，但卻面臨著手術(shù)難度高、效果差、費用昂貴等諸多不利因素。因此，如何提高假體使用年限，避免假體周圍骨溶解逐漸成為研究熱點。研究表明，假體在磨損過程中產(chǎn)生的金屬顆粒會刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞活化，通過核因子-κB 受體活化因子配體(RANKL)激活破骨細(xì)胞表面表達(dá)的核因子-κB 受體活化因子(RANK)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖，介導(dǎo)假體周圍骨溶解［1，2］。本研究在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中加入鈦顆粒，在不同時間點檢測RANK的競爭性受體骨保護(hù)素(OPG)和RANKL 的表達(dá)水平，從而為治療假體周圍骨溶解提供一定的實驗依據(jù)。

材料與方法

1.實驗材料:MC3T3 -E1 細(xì)胞株購自美國ATCC 公司，鈦顆粒購自美國Zimmer 公司，DMEM 培養(yǎng)液購自美國HyClone公司，胎牛血清購自中國TBD 公司，Trizol 購自美國Invitrogen公司，PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，ELISA 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

2.實驗方法:(1)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代:MC3T3 -E1 細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM 培養(yǎng)液5ml，1500r/min 離心5min，棄上清，反復(fù)3 次，去除殘留的二甲基亞砜，加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基5ml 重懸，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每48h 進(jìn)行更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%后，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶1ml 消化30min，加入DMEM 培養(yǎng)液5ml 終止消化。移入離心管1500r/min 離心5min，棄上清。加入DMEM 培養(yǎng)液10ml，吹打混勻后移入兩個培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)傳5 代備用。(2)成骨細(xì)胞的分組:傳至第5 代的成骨細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 ×105/ml，分別移入4 個6 孔板中，每板為1 組，隨機(jī)標(biāo)記為A、B、C、D 共4 組，每組各孔分別標(biāo)記為1 ～6 號孔。各組1 ～3 號孔均加入含有0.1mg/L 鈦顆粒、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);各組4 ～6 號孔均單純加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，作為陰性對照。A、B、C、D 4組分別于培養(yǎng)12、24、36 和48h 后進(jìn)行real - time PCR 和ELISA 檢測OPG 和RANKL 的表達(dá)水平。(3)OPG 和RANKL蛋白表達(dá)的ELISA 檢測:A 組細(xì)胞于培養(yǎng)后12h 分別單獨提取A1 ～A6 號孔的培養(yǎng)液，根據(jù)ELISA 試劑盒說明，96 孔板中A1 ～A6 每種樣品均設(shè)2 個復(fù)孔，進(jìn)行加樣，每孔100μl。封板紙粘貼后，37℃放置60min，洗板后相繼加入抗OPG 或RANKL 的一抗工作液、酶標(biāo)抗體工作液，而后終止反應(yīng)，在450nm 處測定吸光度(A)值，取A1 ～A3 3 組平均A 值與A4～A6 3 組平均A 值進(jìn)行比較。與A 組步驟相同，B、C、D 組也分別在24、36 和48h 進(jìn)行ELISA 檢測。(4)OPG 和RANKL mRNA 表達(dá)的real-time PCR 檢測:A 組細(xì)胞在培養(yǎng)12h 提取培養(yǎng)液進(jìn)行ELISA 檢測后，將剩余貼壁的成骨細(xì)胞用PBS 液沖洗3 次，每孔加入0. 25% 胰酶0. 5ml 消化30min，加入DMEM 培養(yǎng)液終止消化。分別單獨提取A1 ～A6 號孔細(xì)胞，放入去RNA 酶的EP 管中，1500 r/min 離心5min，棄上清，-80℃凍存后加入1ml Trizol 提取總RNA，經(jīng)沉淀、清洗后根據(jù)TARAKA 公司的PCR 試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。向real-time PCR 反應(yīng)體系中加入上下游引物各0.5μl (表1)，cDNA 模板2μl，ddH2O 8.25μl，熒光染料1.25μl，Taq 聚合酶1μl等，以GAPDH 為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:RANKL 94℃變性5min，94℃30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增33 個循環(huán);OPG 和GAPDH 均為94℃變性5min，94℃30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增33 個循環(huán)。根據(jù)PCR 儀給出的Ct 值，計算樣本ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt =ΔCt實驗組-ΔCt對照組，應(yīng)用公式2-ΔΔCt計算OPG 及RANKL 的相對量。與A 組步驟相同，B、C、D 組也分別在24、36 和48h 進(jìn)行real-time PCR 檢測。

表1 實時定量PCR 的引物序列

3.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK -q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代:復(fù)蘇后的成骨細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓球形，折光性強，散在漂浮于培養(yǎng)液中，6h 后逐漸沉降貼壁，24h 后貼壁細(xì)胞完全展開，呈多邊形、三角形等不規(guī)則形態(tài)。細(xì)胞約72h 鋪滿瓶底的80%，進(jìn)行傳代后，細(xì)胞生長良好，連續(xù)傳5 代，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，未見異常核分裂象。A、B、C、D 4 組1 ～3 孔接種鈦顆粒后，可見鈦顆粒平均分布于成骨細(xì)胞周圍，多數(shù)被成骨細(xì)胞所吞噬。

2.OPG 和RANKL 蛋白表達(dá)的ELISA 檢測:A、B、C、D 4 組細(xì)胞分別在12、24、36 和48h 終止干預(yù)，并收集細(xì)胞外液進(jìn)行ELISA 檢測，測得數(shù)值減去零孔值后得到OPG 及RANKL 蛋白A 值見表2?？梢娂尤脞侇w粒后12h，培養(yǎng)液中OPG 及RANKL與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);24 ～48h，OPG 含量逐漸減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，與此同時，RANKL 蛋白含量逐漸增多，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 OPG 和RANKL 蛋白平均吸光度(±s)

表2 OPG 和RANKL 蛋白平均吸光度(±s)

與對照組相比，* P ＜0.05

分組12h 24h 36h 48h OPG 實驗組 10.33±2.44 8.96±2.02* 7.84±1.30* 7.66±0.63*OPG 對照組 11.07±1.77 9.76±0.51 10.06±1.77 9.63±1.11 RANKL 實驗組 6.04±1.60 7.51±0.57* 8.91±0.59* 10.94±0.58*RANKL 對照組5.56±0.97 5.83±0.24 6.13±0.39 6.42±0.23

3. OPG 和RANKL 的mRNA 表達(dá)的real - time PCR 檢測:A、B、C、D 4 組細(xì)胞分別在12、24、36 和48h 終止干預(yù)，并收集細(xì)胞提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR 檢測。RT -PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與基因庫中OPG 和RANKL 的序列吻合，證明RT -PCR 產(chǎn)物為小鼠OPG 和RANKL 的基因序列。各樣本OPG、RANKL 及GAPDH 的mRNA 均明確表達(dá)，根據(jù)所測得Ct 值計算2-ΔΔCt值得到mRNA 相對表達(dá)量，結(jié)果見表3?？梢奜PG mRNA 的表達(dá)在12h 后即開始降低，且持續(xù)下降至48h，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。RANKL mRNA 的表達(dá)與OPG 相反，在12h 后即開始升高，且持續(xù)升高至36h 后趨于穩(wěn)定，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 OPG 和RANKL 的mRNA 相對表達(dá)量(±s)

表3 OPG 和RANKL 的mRNA 相對表達(dá)量(±s)

與對照組相比，* P ＜0.05

分組12h 24h 36h 48h OPG實驗組 0.89±0.07* 0.81±0.11* 0.74±0.15* 0.72±0.16*對照組 1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.16 1.00±0.13 RANKL實驗組 1.21±0.21* 1.22±0.33* 1.24±0.09* 1.24±0.04*對照組1.00±0.06 1.00±0.03 1.00±0.12 1.00±0.16

4. RANKL/OPG 比值的變化:根據(jù)不同時間點RANKL、OPG 在蛋白水平和RNA 水平的測量值，計算RANKL/OPG 的比值，結(jié)果見圖1 及圖2。在12h時兩組比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，而后實驗組比值升高，在24、36 及48h 均高于對照組(P ＜0.05)，說明骨分解代謝增強。由圖2 可見，由于real-time PCR 以對照組為參照計算的特點，對照組呈一直線，實驗組RANKL/OPG 比值增高趨勢，且以24～36h 最為活躍。

討 論

圖1 蛋白水平的RANKL/OPG 比值變化

圖2 mRNA 水平的RANKL/OPG 比值變化

人工髖關(guān)節(jié)置換是治療股骨頭壞死最為有效的方案，隨著幾年來人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)適應(yīng)證的增多，人工髖關(guān)節(jié)置換已經(jīng)成為關(guān)節(jié)外科的常規(guī)手術(shù)。然而，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無菌性松動和假體周圍骨溶解卻成為術(shù)后遠(yuǎn)期棘手的并發(fā)癥，一旦出現(xiàn)假體松動，就需要進(jìn)行關(guān)節(jié)翻修術(shù)，其手術(shù)難度大、風(fēng)險高、費用昂貴［3］。如何防止置換術(shù)后假體松動也隨之成為關(guān)節(jié)外科的研究重點。近年來，國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，RANKL-RANK-OPG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是影響關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動的重要原因［4，5］。

關(guān)節(jié)置換術(shù)后，隨著關(guān)節(jié)的運動摩擦，會有微小的金屬假體顆粒脫落，在關(guān)節(jié)周圍刺激炎性細(xì)胞增生，釋放多種細(xì)胞因子，刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞活化，產(chǎn)生RANKL 蛋白［6］。RANKL 蛋白與破骨細(xì)胞表面的跨膜蛋白RANK 結(jié)合，進(jìn)而通過NF -κB途徑向破骨細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致破骨細(xì)胞大量增殖，從而破壞關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)，導(dǎo)致假體植入術(shù)后骨溶解及假體無菌性松動［7］。RANKL 主要存在于骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中，是腫瘤壞死因子(TNF)配體家族的成員，以跨膜蛋白、可溶性蛋白和全鏈分泌式蛋白3 種形式存在，受IL -1、IL -17、糖皮質(zhì)激素等多種因子刺激而表達(dá)，作用于其受體RANK［8］。RANK首先于樹突細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，屬TNF 受體家族成員，其在進(jìn)化中序列高度保守，多跨膜存在于免疫細(xì)胞及破骨前體細(xì)胞表面［9，10］。當(dāng)破骨細(xì)胞表面RANK 與RANKL 結(jié)合后，即會使破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨溶解［11］。正常生理狀態(tài)下，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間存在著動態(tài)平衡，以保證骨骼的生長代謝，這一過程即依靠OPG 進(jìn)行調(diào)節(jié)［12］。OPG 是成骨細(xì)胞分泌的可溶性蛋白，能夠與RANK 競爭性結(jié)合RANKL 的結(jié)合位點，從而減輕破骨作用［13，14］。OPG是成骨細(xì)胞自身分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，主要受RANKL 濃度影響，RANKL 與OPG 的比例在骨代謝過程中起著極為重要的作用［15，16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鈦顆粒作用于成骨細(xì)胞之后，RANKL 基因的mRNA 表達(dá)水平迅速升高，維持在較高水平，在實驗時間內(nèi)，未見其有下降趨勢。與此同時，OPG 基因的mRNA 表達(dá)水平在逐漸下降，并維持在相對較低水平，并沒有因RANKL 的表達(dá)水平增高而負(fù)反饋調(diào)節(jié)性增高，因此說明了金屬鈦顆粒既能夠促進(jìn)RANKL 的表達(dá)水平增高，又能夠抑制OPG 的負(fù)反饋作用。鈦顆粒的雙重作用使得RANKL/OPG 的比值升高，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的作用強于成骨細(xì)胞的作用，加速骨溶解。鈦顆粒作用12h 后，RANKL 和OPG的mRNA 表達(dá)均開始升高，而培養(yǎng)液中蛋白含量與對照組相比無明顯差異，可能是由于轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程 需 要 時 間 所 致［17，18］。在 不 同 時 間 點 對 各 組RANKL mRNA 含量進(jìn)行單因素方差分析，整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，經(jīng)SNK -q 檢驗后，36h 和48h 之間沒有差別，說明鈦顆粒的作用達(dá)到穩(wěn)定，而在24h 前后，mRNA 上升最為明顯。與之對應(yīng)，24h時OPG 的下降最為明顯，說明了鈦顆粒的主要作用在12 ～24h 之間。但與體外實驗不同，關(guān)節(jié)假體會隨著使用強度、使用時間的不同出現(xiàn)不同程度的磨損，因此鈦顆粒的濃度也不盡相同，不可控因素較多，尚需進(jìn)一步研究［19，20］。

綜上所述，關(guān)節(jié)假體產(chǎn)生的鈦顆粒既能夠上調(diào)RANKL 的表達(dá)水平，又會抑制OPG 的形成，從而加速假體周圍的骨溶解作用。

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