ClC2 調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及其機制的研究進展

赫飛翔 葛子路 楊 志 李紅麗

氯離子通道是分布于細胞膜或細胞器膜上的一類能夠轉(zhuǎn)運氯離子及其他陰離子的通道蛋白，它是機體內(nèi)最重要、最豐富的陰離子通道［1］。氯離子通道在多種生物進程中發(fā)揮重要作用，如細胞周期和細胞凋亡的調(diào)節(jié)、細胞體積的調(diào)節(jié)、突觸的傳遞和細胞興奮性的調(diào)節(jié)等［2～6］。電壓門控型氯離子通道(voltage-gated Cl-channel ，ClC)是氯離子通道的一種，也是目前在原、真核生物中研究得較為深入的一類氯離子通道。

一、ClC 的結(jié)構(gòu)特性和分類

從細菌到人類的所有的生物體中均能找到ClC的同源體，例如大腸桿菌、釀酒酵母中均有ClC 的存在［7］。細菌ClC 蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型顯示ClC蛋白的跨膜區(qū)由A ～R 共18 個傾斜排布在細胞膜上的α-螺旋組成［8］。對大腸桿菌ClC(EcClC)結(jié)構(gòu)的研究表明，EcClC 由兩個完全相同的亞基組成一個近似菱形的復(fù)合體，其長軸10nm、短軸5.5nm，每個亞基的形狀近似三角形，兩個亞基反向平行排列，并且成軸對稱關(guān)系［9］。EcClC 的主體完全嵌合在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)，只有N 端和C 端伸入胞質(zhì)內(nèi)。EcClC 的兩個通道位于每一個亞基的中心，形成雙管型的通道結(jié)構(gòu)。兩個通道相互獨立，具有不同的電壓依賴性，兩個通道的開啟互不干涉，但通道的關(guān)閉卻受同一閘門控制［1］。整個ClC 家族蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)基本相似［7］。

首先被發(fā)現(xiàn)的是存在于電鰩電器官中的ClC0，而在哺乳動物中第1 個被克隆出來的是ClC1。目前哺乳動物的ClC 共有9 種，依據(jù)同源性可將ClC 家族分為3 類:第1 類包括ClC0、ClC1、ClC2，這類ClC 主要在質(zhì)膜上發(fā)揮作用;第2 類包括ClC3、ClC4 和ClC5，這類ClC 主要在胞內(nèi)細胞器膜上發(fā)揮作用;第3 類包括ClC6、ClC7，與第2 類相似主要在細胞器膜上發(fā)揮作用。不同類型的ClC 發(fā)揮不同的功能，如ClC1 的功能主要在于穩(wěn)定骨骼肌細胞膜電壓，而溶酶體ClC7 的破壞會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和溶酶體貯積病［7，10］。由于ClC2 在細胞質(zhì)膜上分布的特性和其在神經(jīng)系統(tǒng)研究中領(lǐng)域所受的高關(guān)注度，本文主要探討ClC2 在神經(jīng)發(fā)育中的作用。

編碼ClC2 的mRNA 存在于幾乎所有的細胞和組織中，其中以腦和上皮組織中分布最多［11］，在腦中，ClC2 在海馬的錐體細胞和小腦的浦肯野細胞內(nèi)高度表達，還存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞中［8］。細胞膜上的負電位增大、細胞體積增大、細胞內(nèi)離子濃度增高、輕度細胞外酸化環(huán)境等均能激活ClC2［11］。小鼠體內(nèi)ClC2 受損可導(dǎo)致睪丸和視網(wǎng)膜的變性退化，這與生殖細胞和光感受器分別依賴支持細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運，而ClC2 的損壞使轉(zhuǎn)運受阻進而破壞了生殖細胞和光感受器內(nèi)的離子平衡有關(guān)［3，4］。

二、ClC2 參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元的主要功能是傳遞信息，神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)細胞之間的信息傳遞主要通過突觸進行。ClC2 能夠調(diào)節(jié)γ -氨基丁酸A(γ-aminobutyric acid，GABAA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)元中的氯離子濃度［12，13］。位于突觸后膜上的GABAA受體是配體門控的氯離子通道，根據(jù)GABAA受體的分布和激活后的電生理特性，可以將GABAA受體分成兩大類:突觸性GABAA受體和突觸外GABAA受體，前者介導(dǎo)GABA 能神經(jīng)元的時相性抑制，后者則介導(dǎo)GABA 能神經(jīng)元的的緊張性抑制。GABAA受體的內(nèi)源性配體GABA 是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)約30%左右的突觸以GABA 為神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)廣泛存在GABA 能神經(jīng)元，主要分布在大腦皮質(zhì)、海馬和小腦。由于細胞外的氯離子濃度遠大于細胞內(nèi)，GABA 和GABAA受體結(jié)合激活受體使氯通道開放，氯離子順濃度梯度進入細胞膜內(nèi)，膜內(nèi)負電位增大產(chǎn)生超極化，使神經(jīng)元的興奮性下降，產(chǎn)生中樞抑制效應(yīng)。但是如果氯離子在短時間內(nèi)不能有效排出細胞外，以保持細胞內(nèi)的低氯環(huán)境，反復(fù)激活GABAA受體則會引起細胞內(nèi)氯離子超載，后者可增加氯離子內(nèi)流的阻力，使突觸后抑制作用明顯減弱。

生理狀態(tài)下，只有HCO-3和Cl-能通過GABAA受體在胞內(nèi)外流動，通常情況下細胞外這些離子的濃度均保持在恒定水平，并且HCO-3是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)PH的主要離子，其細胞內(nèi)的濃度與細胞外濃度基本相同。因此細胞內(nèi)Cl-的濃度對GABAA能神經(jīng)元的活性至關(guān)重要。與配體門控的氯離子通道介導(dǎo)氯離子內(nèi)流不同的是，ClC2 是細胞膜上的內(nèi)向整流氯通道，當(dāng)細胞膜電位低于氯離子的平衡電位時，激活ClC2引起氯離子外流［12］。對大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)上的ClC2 研究表明，處于激活狀態(tài)的GABAA受體將細胞外的氯離子轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，ClC2 能夠及時有效的將這些氯離子排出細胞外，避免氯離子在細胞內(nèi)大量堆積。ClC2 的這種特性不但能維持氯離子的平衡電位在膜靜息電位周圍波動，還能避免神經(jīng)元的興奮性長時間過低，及時恢復(fù)神經(jīng)元的興奮性［13］。

ClC2 的這種特性在防止顳葉性癲癇的發(fā)作中發(fā)揮重要作用。顳葉癲癇是大腦顳葉皮質(zhì)錐體細胞異常放電所引起的嚴重臨床病變。在顳葉性癲癇發(fā)作時，成熟神經(jīng)元中主要的氯離子轉(zhuǎn)運體(KCC2)活性明顯下降，氯離子不能及時從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)入細胞外，引起細胞內(nèi)氯超載，降低GABA 能神經(jīng)元的抑制作用，使腦內(nèi)興奮-抑制作用失衡導(dǎo)致顳葉性癲癇的發(fā)生。最近的研究認為，成年動物的海馬CA 區(qū)，GABA 能神經(jīng)元的緊張性抑制主要由GABAA受體的α5 亞基介導(dǎo)，癲癇發(fā)作時，這種緊張性抑制作用明顯減弱。有研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作時，大鼠CA1 區(qū)錐體細胞膜上ClC2 的活性上調(diào)，而特異性阻斷GABAA受體的α5亞基之后，由于ClC2 的內(nèi)向整流特性，大鼠CA1 區(qū)錐體細胞膜上ClC2 的活性下降［14］。表明在癲癇發(fā)作時機體能通過上調(diào)神經(jīng)元ClC2 活性，及時恢復(fù)神經(jīng)元的抑制作用，并且ClC2 的這種作用與GABAA受體的α5 亞基的活性密切相關(guān)。

三、ClC2 參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞水電解質(zhì)平衡

神經(jīng)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的正?；顒雍臀镔|(zhì)代謝起重要作用。同時大腦和小腦發(fā)育中細胞構(gòu)筑的形成都需要神經(jīng)膠質(zhì)細胞提供原初的框架結(jié)構(gòu)，神經(jīng)軸突再生也必須有膠質(zhì)細胞的導(dǎo)引才能成功。作為細胞內(nèi)最豐富的陰離子，氯離子在細胞膜電位調(diào)控和維持神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)水電解質(zhì)平衡方面所發(fā)揮的重要作用逐漸凸顯。ClC2 基因缺陷小鼠的腦和脊髓白質(zhì)中的神經(jīng)膠質(zhì)附近會形成廣泛的進行性海綿狀空泡，這種空泡和巨頭白質(zhì)腦病伴皮質(zhì)下囊腫(megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts，MLC)患者腦內(nèi)出現(xiàn)的空泡形狀和位置均非常相似［11，15］。MLC 是腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的一種，患者常表現(xiàn)為一歲時出現(xiàn)畸形巨頭，腦白質(zhì)隆起及皮質(zhì)下出現(xiàn)囊腫等。放射性檢查顯示患者大腦含水量較正常人增加，對患者的腦組織進行活檢發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)有空泡存在［16］。腦組織中空泡的產(chǎn)生往往與細胞膜表面的離子運輸功能受損有關(guān)，因為離子運輸受損會導(dǎo)致細胞滲透壓的失衡并對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)造成一定的干擾［5，17～19］，進而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。而ClC2 則被證實參與維持腦白質(zhì)內(nèi)的水和電解質(zhì)的平衡。

腦白質(zhì)主要由有髓鞘的軸突構(gòu)成，這些軸突最重要的生理功能是傳導(dǎo)沖動。動作電位的產(chǎn)生依賴于細胞膜內(nèi)外水和電解質(zhì)的平衡，而腦白質(zhì)內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞則是維持腦內(nèi)水和電解質(zhì)平衡最重要的細胞［16］，他們在腦白質(zhì)內(nèi)大量分布且互相之間聯(lián)系密切。同時在腦白質(zhì)內(nèi)存在一個“盤狀神經(jīng)膠質(zhì)”的合胞體，它是由星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和室管膜細胞通過縫隙連接組成的巨大網(wǎng)絡(luò)［20］。這個巨大的合胞體在腦白質(zhì)內(nèi)的長距離水、電解質(zhì)運輸中發(fā)揮重要作用。在過去的認識中，K+一直被認為是星形膠質(zhì)細胞中調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性的重要離子，鉀離子通道Kir4.1 在其中發(fā)揮重要作用。后來的研究發(fā)現(xiàn)ClC2和Kir4.1 都存在于少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中，由于ClC2 轉(zhuǎn)運Cl-和的特性，ClC2 被認為在調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞之間縫隙內(nèi)的離子平衡和酸堿平衡中起重要作用。

近年來證實MLC 的發(fā)病與基因表達有關(guān)，它是第1 個被人們所知的由基因缺陷引起腦星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡紊亂的疾?。?0］。MLC1 和神經(jīng)膠質(zhì)細胞黏附分子編碼基因(GlialCAM)是導(dǎo)致MLC發(fā)病的兩個致病基因，其中75%的MLC 患者是由于MLC1 基因缺陷導(dǎo)致［11］。GlialCAM 作為MLC1 的亞基，兩者都存在于軸突和星形膠質(zhì)細胞間的局部連接中，敲除星形膠質(zhì)細胞中的MLC1 導(dǎo)致GlialCAM 和ClC2 的表達受抑制，而與MLC1 不同的是，GlialCAM還存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘內(nèi)［11，15］。GlialCAM 同時也是分布在神經(jīng)膠質(zhì)細胞上的ClC2 的輔助性亞基，因此，GlialCAM 的異常很可能引起ClC2 功能的異常，進而破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。但是在隨后的研究中卻發(fā)現(xiàn)CLCN2(編碼ClC2 的基因)基因敲除的小鼠腦組織中雖然產(chǎn)生了水腫樣空泡，卻沒有引起明顯的神經(jīng)系統(tǒng)病理和功能改變，使ClC2 在MLC 的發(fā)生中所起的作用受到懷疑［11］。GlialCAM基因缺陷的MLC 患者腦內(nèi)MLC1 和ClC2 表達均受到影響，但是MLC1 基因缺陷導(dǎo)致的MLC 患者的臨床癥狀較GlialCAM 基因缺陷嚴重，具體的機制至今不明，這其中是否有ClC2 的參與仍然值得進一步研究。而Depienne 等［20］卻認為CLCN2 基因突變所導(dǎo)致的是一種新形式的MLC，在人群中以常染色體隱性遺傳方式存在，發(fā)生率較傳統(tǒng)MLC 低。在白質(zhì)腦病數(shù)據(jù)庫中篩選符合要求的7 例患者，其中對照組為3 例成年發(fā)病型白質(zhì)腦病患者和1 例小腦共濟失調(diào)X 連鎖隱形遺傳患者，實驗組為3 例幼年發(fā)病型白質(zhì)腦病且CLCN2 基因突變患者，通過MRI 檢查患者腦部病變情況。通過對患者CLCN2 基因測序發(fā)現(xiàn)p. Leu144_Ile145del 和p.Ala500Val 的突變導(dǎo)致ClC2跨膜區(qū)的疏水性氨基酸表達異常，進而影響ClC2 的功能。實驗結(jié)果表明實驗組腦髓鞘內(nèi)確實存在進行性空泡，ClC2 是維持星形膠質(zhì)細胞內(nèi)水電解質(zhì)平衡的重要部分，證實了ClC2 在維持神經(jīng)膠質(zhì)細胞水電解質(zhì)平衡中的重要作用。

四、ClC2 過度活化促進神經(jīng)細胞凋亡

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起重要的作用，生理性的細胞凋亡是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施，病理性的細胞凋亡則會對機體的發(fā)育和正常功能造成損害。在早期胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起源于外胚層，在神經(jīng)胚形成早期，神經(jīng)管神經(jīng)上皮中存在著大量具有定向分化能力的神經(jīng)干細胞，乙醇、高濃度葡萄糖和咖啡因等均能對細胞的發(fā)育環(huán)境造成影響，任何原因引起神經(jīng)干細胞的早期凋亡均可影響神經(jīng)管的正常發(fā)育，對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育影響極大。妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖耐量異常，包括在妊娠前已存在但未被診斷的糖耐量異?；蛱悄虿　Ｓ醒芯恐赋鯣DM 能引起神經(jīng)干細胞的過度凋亡進而影響神經(jīng)管的發(fā)育并引發(fā)神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，氯離子在細胞凋亡中發(fā)揮的作用日益凸顯。在對大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)氯離子的過度外流是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的主要原因。在腫瘤壞死因子介導(dǎo)的大鼠肝細胞凋亡實驗中，凋亡肝細胞中的氯電流是正常肝細胞的5 倍，提示氯離子的過度外流在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

細胞凋亡的原因和可能的機制層出不窮。大多數(shù)情況下來自細胞外的凋亡誘導(dǎo)因素作用于細胞后可轉(zhuǎn)化為細胞凋亡信號，并通過胞內(nèi)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細胞死亡途徑，最終導(dǎo)致細胞凋亡。目前研究較多的與細胞凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)主要有:PI3K-Akt 信號系統(tǒng)、cAMP/PKA 信號系統(tǒng)、PTK 信號系統(tǒng)等。有研究表明PI3K -Akt 信號通路和氯離子通道間關(guān)系緊密，Junshan 等對從蟾毒中提取出的一種新型氯通道激活劑——蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯的研究中發(fā)現(xiàn)，氯離子通道的過度活化，能抑制PI3K -Akt 通路的表達，促使腫瘤細胞的凋亡，達到抗腫瘤的效果。

4，4 -二異硫氰基芪-2，2' -二磺酸(4，4' -Diisothiocyanostilbene -2，2' - disulfonic acid，DIDS)是ClC2 的非特異性阻斷劑，在神經(jīng)系統(tǒng)的研究實驗中已證實DIDS 阻斷氯離子通道后可以抑制大鼠小膠質(zhì)細胞的過度活化，使細胞保持正常的容積和生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，DIDS 能夠激活PI3K -Akt 通路抑制心肌細胞凋亡，減輕缺血/再灌注對心肌組織的損傷，提示氯離子通道的過度活化導(dǎo)致細胞的凋亡的發(fā)生，且這一過程很可能通過抑制PI3K -Akt 的表達實現(xiàn)的。同時Ho 等發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡過程中，PI3K - Akt 通路的磷酸化起到抑制細胞凋亡，保護血管內(nèi)皮的作用也提示PI3K -Akt 通路在高糖誘導(dǎo)細胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。

PI3K-Akt 信號途徑是一條經(jīng)典的信號途徑，參與細胞凋亡的調(diào)控，并且主要表現(xiàn)為抑制細胞凋亡，可能與下面幾種機制有關(guān):①PI3K -Akt 通過抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員的活化，抑制caspase 導(dǎo)致細胞凋亡;②調(diào)節(jié)bcl -2 家族成員的活性，PI3K-Akt 的激活可以使bcl-2 家族中的促凋亡蛋白Bad 的Ser136/Ser112 殘基磷酸化，磷酸化的Bad 與抑制細胞凋亡蛋白bcl -2 或bcl -xL 解聚，使bcl-2 發(fā)揮抗凋亡作用;③抑制促凋亡基因FasL 的表達，活化的Akt 能夠磷酸化FKHR 蛋白，抑制FKHR 進入細胞核誘導(dǎo)的FasL 表達，從而抑制細胞凋亡;④轉(zhuǎn)錄因子NF -κB 活化進入細胞核，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等。

目前已經(jīng)證實母體妊娠糖尿病是導(dǎo)致新生兒畸形的重要因素，其引起新生兒畸形的概率高達6% ～10%，其誘發(fā)的器官缺陷累及神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等，在諸多畸形中以神經(jīng)管缺陷最為常見。而目前妊娠糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)干細胞凋亡的具體機制仍不清楚，使母體妊娠糖尿病致胎兒神經(jīng)管缺陷在臨床治療上仍存在很大難度。因此，探究氯離子通道在妊娠糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷中的作用將進一步推動對妊娠糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷生理及病理全過程的了解。

ClC2 廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，它在神經(jīng)細胞凋亡過程中發(fā)揮的作用不可忽視。但目前ClC2 過度活化和神經(jīng)細胞凋亡關(guān)系的文獻報道尚少，有研究指出在缺血缺氧性腦損傷中，ClC2 的過度活化導(dǎo)致了少突膠質(zhì)細胞的凋亡，而氯離子通道阻斷劑DIDS 能在這一損傷中有效保護少突膠質(zhì)細胞，這一發(fā)現(xiàn)無疑對ClC2 的活性影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。

五、展 望

氯離子是機體內(nèi)最重要、最豐富的陰離子，2 型電壓門控氯離子通道(ClC2)作為眾多氯離子通道的一種，是目前研究的熱點，也是目前研究較為深入的一種電壓門控通道。其在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性、參與神經(jīng)組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而ClC2 的過度活化可能通過抑制PI3K -Akt 通路的磷酸化促進神經(jīng)細胞的凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)作為機體中起主導(dǎo)作用的系統(tǒng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性至關(guān)重要。關(guān)于CLCN2 基因的缺陷是否是導(dǎo)致腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的原因之一，雖然目前仍存在爭議，但ClC2 對神經(jīng)組織的保護作用越來越引起人們重視。ClC2 的過度開放是否是母體妊娠糖尿病導(dǎo)致胚胎神經(jīng)管缺陷機制中的一個環(huán)節(jié)，值得進一步深入研究，毫無疑問，高糖環(huán)境下抑制神經(jīng)干細胞的早期凋亡，對確保胎兒神經(jīng)管的正常發(fā)育具有非常重要的意義。目前ClC2 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用的具體機制仍有很多不清楚之處，對這一領(lǐng)域的研究仍需付出更多的努力。

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