高脂血癥大鼠hepcidin 的表達(dá)異常及川芎嗪的干預(yù)研究

孫明月 郭春雨 王景尚 劉 欣 張 淼 王 琳 殷惠軍

高脂血癥是由脂質(zhì)代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常引起的全身性慢性炎性疾病，在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。鐵調(diào)素(hepcidin)是一種由肝細(xì)胞分泌后釋放入血漿經(jīng)尿液排出的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的抗菌蛋白，它是鐵經(jīng)腸黏膜吸收、由巨噬細(xì)胞回收、轉(zhuǎn)移至肝儲(chǔ)存的自我平衡調(diào)節(jié)器，在鐵代謝中起關(guān)鍵作用。

已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明［1］，鐵過負(fù)荷可引起小鼠的血脂代謝紊亂，但血脂代謝異常是否會(huì)對(duì)hepcidin 的表達(dá)產(chǎn)生影響從而影響AS 的進(jìn)程，尚未有充分的研究說明。肝素除抗凝作用外，還可通過抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖、調(diào)節(jié)血脂代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用以抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［2］。Poli 等［3］發(fā)現(xiàn)，肝素可通過抑制BMP/SMAD 及JAK/ STAT 兩條通路從而抑制hepcidin 的表達(dá)，故本次研究采用肝素作為陽性對(duì)照。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的根莖中提取的有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗激素硬化及抗血小板等作用，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療［4］。因川芎嗪對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且本課題組前期已證實(shí)川芎嗪對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)的hepcidin 具有抑制作用，故本次實(shí)驗(yàn)選用川芎嗪并研究其對(duì)體內(nèi)hepcidin 表達(dá)的影響，觀察其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用是否與hepcidin 的表達(dá)有關(guān)，并探索其機(jī)制［5］。本研究通過給予高脂飲食大鼠不同處理后觀察血清hepcidin 表達(dá)的變化，探討高脂血癥對(duì)大鼠血清hepcidin 表達(dá)的影響及川芎嗪對(duì)其干預(yù)作用，為高脂血癥的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的思路及科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.研究對(duì)象:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體重180 ～200g，4 周齡，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK 京2011 -0004)。飼料:普通飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，高脂飼料購自北京諾康源生物科技有限公司，配方為1%膽固醇、0.2%膽酸鹽、10%豬油、10%蛋黃粉及78.8% 基礎(chǔ)飼料。

2.試劑及儀器:藥物:鹽酸川芎嗪注射液(北京市永康藥業(yè)有限公司，批號(hào):13070401)，肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司，批號(hào):130608)。主要試劑:生化檢測(cè)甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)試劑(購于北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為:ZL3103AA21 及ZL3103AA22)，大鼠血清鐵調(diào)素(hepcidin)、腫瘤壞死因子-α(TNF -α)、白細(xì)胞介素1(IL -1)及白細(xì)胞介素6(IL -6)ELISA 試劑盒(購于AMEKO 公司，批號(hào):201312)。主要儀器:UV-2000 型紫外分光光度計(jì)(上海市尤尼柯公司)，352 型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司)，AC8 型洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems 公司)，GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn))，高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3 -18k)，CS -T300 型全自動(dòng)生化分析儀(長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司)。

3.方法:(1)高血脂癥模型的制備:40 只大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料1 周后，隨機(jī)抽取10 只以普通飼料喂養(yǎng)8 周設(shè)為空白對(duì)照組。將剩余30 只隨機(jī)分為3 組，每組10 只，均以高脂飼料喂養(yǎng)8 周。(2)分組及給藥:空白對(duì)照組及模型組大鼠喂養(yǎng)8 周后，給予生理鹽水2ml/(kg·d)腹腔注射;肝素陽性對(duì)照組高脂喂養(yǎng)8 周后給予肝素鈉注射液5mg/(kg·d)腹腔注射;川芎嗪組高脂喂養(yǎng)8 周后給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射，各組注射均連續(xù)7 天。所有大鼠在高脂和普通飼料分組后，實(shí)驗(yàn)過程中飼養(yǎng)條件不發(fā)生改變。(3)取材:空白對(duì)照組及模型組大鼠于喂養(yǎng)4 周時(shí)，分別于眼眶取血2ml，在室溫下靜置1h 后，經(jīng)過高速冷凍離心機(jī)離心，3000r/min，離心15min，吸取上層血清，待測(cè)。各組大鼠添加藥物7 天后，禁食不禁水8h，7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射，在麻醉狀態(tài)下沿腹正中線切開胸腹部，推開腹腔臟器，暴露腹主動(dòng)脈，10ml 注射器穿刺取血置于促凝采血管中，并將在取血時(shí)發(fā)生凝血、溶血的血樣廢棄，其中包括空白對(duì)照組2 只、模型組3 只、肝素組2 只及川芎嗪組2 只大鼠的血樣，其余于室溫靜置1h 后高速冷凍離心機(jī)離心，3000r/min，離心15min，吸取上層血清，待測(cè)。取血后立即分離肝臟，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織切片技術(shù)，固定于4%多聚甲醛中。

4.各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定:大鼠血清測(cè)定以下指標(biāo):全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂指標(biāo)，包括TG、TC;大鼠血清hepcidin、TNF -α、IL -1 及IL -6，測(cè)定方法及步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

5.肝組織病理學(xué)檢測(cè):肝組織固定7 天后，進(jìn)行石蠟包埋，制作組織切片及HE 染色，用于肝組織形態(tài)學(xué)觀察。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)中服從正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)之間的差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠血脂水平比較:與空白對(duì)照組(9 周)相比，模型組(9 周)、肝素對(duì)照組及川芎嗪組的血清膽固醇均升高，模型組(9 周)及川芎嗪組的甘油三酯均升高(P ＜0.05);與空白對(duì)照組(4 周)相比，模型組(4 周)的血清膽固醇升高(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清TC、TG 水平的比較(±s)

表1 各組大鼠血清TC、TG 水平的比較(±s)

與空白對(duì)照組(9 周)比較，#P ＜0. 05;與模型組(9 周)比較，* P ＜0.05

組別 時(shí)間(周) n TC(mmol/L) TG(mmol/L)空白對(duì)照組 4 10 1.77 ±0.14* 0.94 ±0.38*空白對(duì)照組 9 8 2.07 ±0.18* 1.03 ±0.27*模型組 4 10 2.31 ±0.36* 0.95 ±0.26*模型組 9 7 3.73 ±0.45# 1.32 ±0.10#肝素對(duì)照組 9 8 3.55 ±0.53# 1.28 ±0.12*川芎嗪組 9 8 3.62 ±0.86# 1.31 ±0.28*

2.肝組織病理改變:HE 染色后鏡下可見，空白對(duì)照組的肝小葉和肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻;模型組肝組織小葉結(jié)構(gòu)欠清，明顯可見彌漫性大小不一的圓形脂肪空泡，伴有水樣變性、炎性細(xì)胞浸潤及凋亡的肝細(xì)胞;肝素組及川芎嗪組的脂肪樣變則明顯改善，見圖1。

圖1 肝組織病理改變(HE，×200)

3.川芎嗪對(duì)高脂血癥大鼠血清hepcidin 的影響:與空白對(duì)照組(4 周)比較，模型組(4 周)的hepcidin的表達(dá)升高(P ＜0.05);與空白對(duì)照組(9 周)比較，模型組(9 周)hepcidin 表達(dá)顯著升高(P ＜0.05);與模型組(4 周)比較，模型組(9 周)hepcidin 表達(dá)的值升高(P ＜0.05);肝素對(duì)照組與川芎嗪組hepcidin 表達(dá)的值與空白對(duì)照組(9 周)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)(P ＞0.5);與模型組(9 周)比較，肝素對(duì)照組與川芎嗪組hepcidin 表達(dá)的值均降低(P ＜0.05)，詳見表2。

4.川芎嗪對(duì)高脂血癥大鼠血清TNF -α、IL -1及IL-6 的影響:與空白對(duì)照組(9 周)相比，模型組(9周)的血清TNF - α、IL -1及IL -6均升高(P ＜0.05);與模型組(9 周)相比，肝素對(duì)照組與川芎嗪組的血清TNF-α、IL -1 及IL -6 均降低(P ＜0.05)，詳見表3。

表2 各組血清hepcidin 的比較(±s)

表2 各組血清hepcidin 的比較(±s)

與空白對(duì)照組(9 周)比較，* P ＜0.05;與模型組(9 周)比較，#P ＜0.05

組別 時(shí)間(周) n hepcidin(μg/L)空白對(duì)照組 4 10 130.90 ±12.90#空白對(duì)照組 9 8 132.76 ±13.24#模型組 4 10 138.95 ±20.88#模型組 9 7 156.51 ±24.95*肝素對(duì)照組 9 8 121.17 ±13.34#川芎嗪組 9 8 127.74 ±14.98#

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1 及IL-6 的比較(±s)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1 及IL-6 的比較(±s)

與空白對(duì)照組(9 周)比較，* P ＜0.05;與模型組(9 周)比較，#P ＜0.05

組別 時(shí)間(周) n TNF-α(ng/L) IL-1(ng/L) IL-6(ng/L)空白對(duì)照組 9 8 52.75 ±7.88# 179.31 ±15.78# 28.32 ±0.90#模型組 9 7 58.99 ±4.39* 199.11 ±12.64* 32.76 ±0.94*肝素對(duì)照組 9 8 50.86 ±9.08# 166.38 ±21.58# 25.00 ±1.25#川芎嗪組 9 8 52.13 ±9.14# 173.24 ±25.80# 27.85 ±0.90#

討 論

機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)生命體的新陳代謝平衡起至關(guān)重要的作用，hepcidin 對(duì)于鐵穩(wěn)態(tài)的維持有著重要的意義，有許多疾病的致病機(jī)制也與hepcidin 的異常表達(dá)相關(guān)。研究顯示，調(diào)控hepcidin 表達(dá)的信號(hào)通路中較重要的是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的BMP/SMAD 信號(hào)通路以及JAK /STAT 信號(hào)通路，炎性因子可通過JAK /STAT 信號(hào)通路來調(diào)控hepcidin 的表達(dá)，且JAK/STAT 通路對(duì)hepcidin 的調(diào)控依賴于SMAD4 的存在［6］。

隨著鐵代謝與AS 的相關(guān)性研究逐漸增多，鐵在AS 進(jìn)展中的促進(jìn)作用已得到證實(shí)，主要表現(xiàn)為:在AS 的初期就已出現(xiàn)斑塊內(nèi)鐵沉積增多，通過限鐵飲食或鐵螯合劑治療則可減少鐵沉積、改善AS 及斑塊的穩(wěn)定性。而hepcidin 可在AS 的斑塊中高表達(dá)，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，其可促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性，并使巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵沉積增多［7，8］。通過以上所述，可知hepcidin 與AS 斑塊內(nèi)的鐵沉積及斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)，但尚未有研究探索AS 發(fā)生、發(fā)展中血清hepcidin 的表達(dá)情況及其機(jī)制。

本研究通過建立高脂模型，觀察血脂變化對(duì)血清hepcidin 表達(dá)的影響;采用已知對(duì)hepcidin 有明顯抑制作用的肝素做為陽性對(duì)照，觀察川芎嗪對(duì)高脂大鼠hepcidin 表達(dá)的影響。通過對(duì)不同時(shí)間段的血脂及血清hepcidin 的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組(9 周)比較，模型組(9 周)、肝素對(duì)照組與川芎嗪組的血脂均升高，說明肝素及川芎嗪對(duì)血脂無明顯降低作用，而血清hepcidin 的表達(dá)隨著血脂的升高而升高，此結(jié)果表明血清hepcidin 的表達(dá)與血脂升高呈正相關(guān)，與此同時(shí)炎性因子IL -1、IL -6 及TNF -α 的表達(dá)均增加，說明炎癥與hepcidin 的表達(dá)在高脂血癥中有著密切聯(lián)系。

已有大量研究表明，炎癥在AS 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，IL -1、IL -6 及TNF -α 等炎性因子可作為AS 的炎性標(biāo)志物及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子，炎性因子可損傷血管內(nèi)皮，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在內(nèi)膜下增殖，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞增加，促進(jìn)斑塊的形成。炎性因子可誘導(dǎo)hepcidin 的表達(dá)，包括IL-1、IL-6 及TNF -α，其中對(duì)IL -6 的研究最為深入，其可通過刺激JAK/STAT 信號(hào)通路來調(diào)控鐵調(diào)素的表達(dá)［9～11］。故推測(cè)hepcidin 表達(dá)的升高可能與高脂血癥的炎癥狀態(tài)有關(guān)，且炎性因子可促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，使膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降解而導(dǎo)致鐵沉積增多，從而進(jìn)一步促進(jìn)AS。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，川芎嗪組與肝素對(duì)照組的hepcidin 的含量均顯著低于模型組(9 周)，同時(shí)兩組血清IL-1、IL -6 及TNF -α 表達(dá)均降低，但肝素對(duì)照組的各項(xiàng)指標(biāo)下降更為明顯。川芎嗪組血清hepcidin 的含量顯著低于模型組(9 周)，說明其對(duì)高表達(dá)的hepcidin 具有明顯的抑制作用，這與本課題組前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，從而進(jìn)一步證實(shí)了川芎嗪對(duì)hepcidin 高表達(dá)的抑制作用，同時(shí)川芎嗪組的血清IL-1、IL -6 及TNF -α 表達(dá)均降低，而川芎嗪的抗炎作用已通過多個(gè)研究證實(shí)，故川芎嗪可能通過抑制IL-1、IL -6 及TNF -α 等炎性因子的表達(dá)而影響hepcidin 的炎癥相關(guān)通路，最終抑制了血清hepcidin的表達(dá)［12，13］。通過本研究顯示，川芎嗪與肝素對(duì)炎性因子及hepcidin 高表達(dá)均有明顯抑制作用，但川芎嗪對(duì)炎性因子及hepcidin 高表達(dá)的抑制作用尚不及肝素。

本研究結(jié)果顯示，高脂血癥可引起hepcidin 的表達(dá)升高，川芎嗪與肝素對(duì)炎性因子及hepcidin 高表達(dá)均有明顯抑制作用，這提示川芎嗪及肝素可能通過其抗炎作用以抑制hepcidin 的高表達(dá)，從而進(jìn)一步發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化及防治冠心病的作用。然而，體內(nèi)脂質(zhì)代謝與hepcidin 表達(dá)之間可能存在復(fù)雜的聯(lián)系，現(xiàn)有研究尚存在爭議，川芎嗪對(duì)hepcidin 高表達(dá)的抑制作用亦可能存在對(duì)其他通路的影響，本課題組將對(duì)其機(jī)制及不同劑量的川芎嗪對(duì)hepcidin 及相關(guān)指標(biāo)的影響進(jìn)行更深入的研究。

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