PKCβ2 途徑抑制藥物L(fēng)Y333531 延緩高糖誘導(dǎo)心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

蘇 文 蘇兆林 陳 暉 李虹偉 王 萍

高糖環(huán)境中糖基化終末產(chǎn)物合成增多，氧化應(yīng)激、炎性因子等激活，從而刺激心臟成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外膠原的合成，引起糖尿病性心肌纖維化，使心臟順應(yīng)性和收縮功能下降，發(fā)生泵衰竭［1］。糖尿病心肌纖維化進(jìn)展的速度和程度決定了糖尿病心臟并發(fā)癥的預(yù)后。而目前臨床上使用的ACEI、ARB、醛固酮拮抗劑等藥物對(duì)延緩心肌纖維化雖具有一定作用，但其治療效果有限［2］。

PKC 是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，但其亞型具有種屬及器官分布的特異性，人和大鼠心臟中主要分布的PKC 亞型為α、β1、β2、ε 和δ［3，4］。文獻(xiàn)報(bào)道，多種信號(hào)通路參與了心肌纖維化的過程，在各種原因?qū)е碌男募±w維化中，PKC 途徑的激活起到了至關(guān)重要的作用，而針對(duì)高糖引起的心肌纖維化過程，又以PKCβ2途徑的作用更為顯著［5］。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上觀察PKCβ2途徑抑制劑LY333531 對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖及活化的影響，為臨床上防治糖尿病心肌纖維化提供新的思路。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:新生1 ～3 天SD 乳鼠，雌雄不限，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基:美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清:美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(DMSO)、MTT:美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品，LY333531:美國(guó)Enzo Life Science 公司產(chǎn)品，抗鼠波形蛋白單克隆一抗、即用型SABC 免疫組化染色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司，PⅠCP、PⅢNP定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒:美國(guó)EDL 公司產(chǎn)品。胞質(zhì)蛋白膜蛋白提取試劑盒:北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)大鼠心臟成纖維細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)及純度鑒定:取1 ～3 天SD 乳鼠的心臟，將心室肌組織剪碎，37℃胰酶消化，收集細(xì)胞，加入培養(yǎng)液(DMEM +15%胎牛血清+谷氨酰胺+雙抗)，差速貼壁60min，獲得心臟成纖維細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過抗波形蛋白免疫組化染色法進(jìn)行鑒定。傳代培養(yǎng)后，2 代細(xì)胞能夠達(dá)到95%為心臟成纖維細(xì)胞的純度，以2 代心臟成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象。(2)實(shí)驗(yàn)分組:正常糖(normal glucose，NG)組:培養(yǎng)液中含5.6mmol/L D-葡萄糖的DMEM，高糖(high glucose，HG)組:培養(yǎng)液中含25mmol/L D - 葡萄糖的DMEM，HG +LY333531 組:培養(yǎng)液中含25mmol/L D - 葡萄糖的DMEM、200nmol/L LY333531，滲透壓對(duì)照(osmotic control，OSM)組:培養(yǎng)液中含5.6mmol/L D -葡萄糖的DMEM、19.4mmol/L 甘露糖。(3)MTT(噻唑藍(lán))法檢測(cè)細(xì)胞增殖:二代心臟成纖維細(xì)胞以5000 個(gè)/孔接種到96 孔板上，貼壁后，加入無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液使細(xì)胞靜息24h。按實(shí)驗(yàn)分組加入各組培養(yǎng)液，作用48h，培養(yǎng)結(jié)束前4h 每孔加入5mg/ml MTT 20μl，4h后每孔加入DMSO150μl 使紫藍(lán)色沉淀溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔調(diào)零。(4)ELISA 法測(cè)定各組PⅠCP、PⅢNP 的表達(dá)量:采用雙抗體夾心-ELISA 法，用抗大鼠PⅠCP 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的大鼠PⅠCP 與單抗結(jié)合，加入生物素化抗大鼠PⅠCP 多抗，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的生物素抗體與之結(jié)合，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm 處測(cè)A 值。畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將濃度作為X 軸(對(duì)數(shù)軸)，A 值作為Y 軸(線性軸)，根據(jù)樣品A 值在該曲線圖上查出相應(yīng)大鼠PⅠCP 含量。PⅢNP 表達(dá)量的檢測(cè)同PⅠCP。(5)Western blot 法檢測(cè)各組PKCβ2活性:收集細(xì)胞后，按試劑盒說明分離細(xì)胞漿與細(xì)胞膜蛋白。將待檢測(cè)蛋白樣品上樣，濃縮膠恒壓90V，約20min;分離膠恒壓120V，通過預(yù)染蛋白marker 來(lái)確定電泳停止時(shí)間。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。取出PVDF 膜置平皿，加5%脫脂奶粉封閉液，室溫緩慢搖動(dòng)1h 進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后加入抗PKCβ2抗體進(jìn)行結(jié)合，封口，室溫緩慢搖動(dòng)過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶500)溶液4ml，封口，置平皿室溫緩慢搖動(dòng)1 ～2h。取出PVDF 膜，ECL顯影，應(yīng)用激光光密度儀掃描分析蛋白表達(dá)量。

3.數(shù)據(jù)處理方法:使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組資料比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.高糖對(duì)心臟成纖維細(xì)胞PKCβ2途徑蛋白水平的影響:高糖孵育心臟成纖維細(xì)胞48h 后，Western blot 法檢測(cè)顯示細(xì)胞胞質(zhì)中PKCβ2表達(dá)量明顯高于NG 組(0.483 ±0.016 vs 0.190 ±0.017，P ＜0.05)，同時(shí)胞膜上PKCβ2表達(dá)量亦高于NG 組(0. 453 ±0.015 vs 0.390 ±0. 016，P ＜0. 05)。而對(duì)于細(xì)胞PKCβ2表達(dá)總量來(lái)說，HG 組也是明顯高于NG 組(0.940 ±0.102 vs 0.581 ±0.017，P ＜0.05，圖1)。可見高糖環(huán)境可以很大程度上促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中PKCβ2途徑的活化。

圖1 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜中PKCβ2 表達(dá)量

2. 高糖對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響及LY333531 的干預(yù)作用:HG 組的細(xì)胞吸光度值明顯高于NG 組(0. 211 ± 0. 020 vs 0.176 ± 0. 016，P ＜0.05)，可見高糖干預(yù)可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。OSM組與NG 組的吸光度值相比則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.182 ±0.015 vs 0.176 ±0.016，P ＞0.05)，表明高糖對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用與滲透壓無(wú)關(guān)。HG +LY333531 組的吸光度值明顯低于HG 組(0.167 ±0.028 vs 0.211 ±0.020，P ＜0.05)，表明LY333531干預(yù)可抑制高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖(圖2)。

圖2 MTT 法檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞的增殖數(shù)量

3.高糖對(duì)心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)PⅠCP、PⅢNP 含量的影響及LY333531 的干預(yù)作用:如表1 所示，HG組心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)PⅠCP、PⅢNP 含量明顯高于NG 組，意味著高糖能促使心臟Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)。當(dāng)加入PKCβ2途徑抑制劑LY333531 與高糖共同孵育心臟成纖維細(xì)胞時(shí)，PⅠCP、PⅢNP 表達(dá)量較HG 組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但與NG 組相比，PⅠCP、PⅢNP 表達(dá)量仍稍高(P ＜0.05)，可見抑制PKCβ2途徑能很大程度上減少心臟Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)。

表1 各組心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)PⅠCP、PⅢNP 量

討 論

PKC 途徑是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的中心，參與了很多病生理過程，尤其是PKCβ2亞型，與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，HG 組胞質(zhì)中和胞膜上PKCβ2表達(dá)量均高于NG 組，證明高糖環(huán)境可以很大程度上促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞PKCβ2的表達(dá)。Xia等［7］發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠發(fā)生心肌肥厚時(shí)心臟內(nèi)表達(dá)增加的主要是PKCβ2信號(hào)蛋白及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，此增加可以被抗氧化劑所拮抗，據(jù)此可推測(cè)高糖環(huán)境通過激活PKCβ2途徑使氧化應(yīng)激增加，進(jìn)而促使心肌纖維化進(jìn)展。

心肌纖維化體現(xiàn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)含量的多少，由心臟成纖維細(xì)胞的增殖和活化決定［8］。本實(shí)驗(yàn)用MTT 法比較發(fā)現(xiàn)，HG 組心臟成纖維細(xì)胞的增殖數(shù)量明顯高于NG 組。而心臟成纖維細(xì)胞的活化則表現(xiàn)為其合成細(xì)胞外基質(zhì)的增多，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)包括膠原蛋白、層粘連蛋白及纖維連接蛋白等，其中占據(jù)主要比例的是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。而Ⅰ型膠原形成前裂解的羧基末端形成PⅠCP，Ⅲ型膠原形成前裂解的氨基末端形成PⅢNP，因此本實(shí)驗(yàn)采用PⅠCP及PⅢNP 分別代表Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成量，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖確實(shí)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白［9］。LY333531 是目前公認(rèn)的高選擇性PKCβ2抑制劑，它在治療糖尿病視網(wǎng)膜病變方面已經(jīng)通過了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，而在治療心肌纖維化方面的研究較少［10］。筆者選用LY333531 作為干預(yù)藥物，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖及ELISA 法檢測(cè)PⅠCP 及PⅢNP 的含量，證實(shí)使用LY333531 阻斷PKCβ2途徑可以抑制高糖環(huán)境下成纖維細(xì)胞的增殖和活化，進(jìn)而抑制心肌纖維化的過程。

綜上所述，本研究初步證實(shí)PKCβ2途徑在高糖誘導(dǎo)心肌纖維化的過程中起到重要作用，而LY333531 作為干預(yù)藥物抑制PKCβ2途徑可以在一定程度上延緩高糖誘導(dǎo)的心肌纖維化過程。

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