60Co-γ射線輻照對長紫菜的誘變效果及優(yōu)良品系分離與特性分析

李淑平，嚴興洪，2*

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306)

60Co-γ射線輻照對長紫菜的誘變效果及優(yōu)良品系分離與特性分析

李淑平1，嚴興洪1，2*

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306)

長紫菜野生型品系(PD-WT)的葉狀體經(jīng)60Co-γ射線輻照處理后再培養(yǎng)4周，出現(xiàn)了棗紅、淺桔紅、黃綠、淺桔黃等顏色的色素變異細胞塊，其百分率隨著輻照劑量的增加而增加；同時，從基部到梢部，其變異率也呈現(xiàn)上升趨勢。利用酶解法獲得的單個色素變異細胞經(jīng)離體培養(yǎng)后再生成葉狀體，從再生體中篩選出具有明顯生長優(yōu)勢的新品系(PD-5)。培養(yǎng)30～70 d，PD-5品系的葉狀體最大絕對生長率和平均絕對生長率分別為3.76 cm/d和2.71 cm/d，分別是PD-WT品系的3.60倍和4.22倍。日齡70 d時，PD-5品系的葉狀體平均體長為117.42 cm，是PD-WT品系的4.32倍。日齡45 d的葉狀體，PD-5品系的葉綠素a和總藻膽蛋白含量分別為8.41 mg/g和97.07 mg/g，分別比PD-WT品系增加了25.71%和104.44%；PD-5品系的葉狀體平均厚度為26.79 μm，比PD-WT品系降低了35.04%。PD-5品系的殼孢子放散總量高達421.16 萬個/貝殼，是PD-WT品系的2.19倍。綜上所述，與PD-WT品系相比，PD-5品系在葉狀體的生長、3種主要光合色素和色素蛋白含量以及殼孢子放散量等方面，均表現(xiàn)出很明顯的優(yōu)勢，有望被培養(yǎng)成可大規(guī)模栽培的新品種。

長紫菜；葉狀體；60Co-γ射線；色素變異；體細胞再生體；優(yōu)良品系

1 引言

紫菜屬(Pyropia)[1]在系統(tǒng)分類學(xué)上隸屬于紅藻門(Rhodophycophyta)、紅藻綱(Rhodophyceae)、紅毛菜亞綱(Bangiophycidea)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)，是具有重要經(jīng)濟和藥用價值的大型藻類，廣泛分布于世界各地，部分物種被廣泛栽培[2]。在我國被大規(guī)模栽培的紫菜有長江以南的壇紫菜和長江以北的條斑紫菜，國內(nèi)外對這兩種紫菜的基礎(chǔ)生物學(xué)、生活史、人工采苗、養(yǎng)殖技術(shù)及遺傳育種等的研究均有大量報道[2]。

在自然界，長紫菜(Pyropiadentata)多分布于壇紫菜生長的潮位之上[3—4]，現(xiàn)已被小規(guī)模試栽的長紫菜為生長慢、成熟早、產(chǎn)量低的野生型品系[5—7]，因此，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的長紫菜新品種對進一步擴大該紫菜的栽培具有一定的意義。

近十多年來，我國的壇紫菜和條斑紫菜遺傳育種工作取得了長足的進步，已培育出了數(shù)個分別具有耐高溫、耐低鹽、耐低氮磷、生長快等不同特性的優(yōu)良品系(種)[8—15]，所采用的育種技術(shù)主要有誘變育種和雜交育種。誘變育種是指利用物理和化學(xué)等誘變因子，人工誘發(fā)生物體產(chǎn)生基因突變，從突變體中篩選出具有生長等優(yōu)勢的生物個體的過程[16]，其中物理誘變具有變異率高、處理簡單、周期短等優(yōu)點，在紫菜遺傳育種中也被廣泛應(yīng)用[17]。我國藻類學(xué)者已利用60Co-γ射線分別對野生型的壇紫菜和條斑紫菜進行人工誘變處理，篩選出了數(shù)個被國家認定的壇紫菜和條斑紫菜新品種，并在生產(chǎn)中得到了較大規(guī)模的推廣[13—14，18]。

本文將首次利用60Co-γ射線對野生型長紫菜進行人工誘變處理，以期獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的長紫菜優(yōu)良品系。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗所用材料為長紫菜野生型品系(PD-WT)，于2012年2月，采自廣東省汕頭市南澳島，由果孢子萌發(fā)長成的自由絲狀體被長期保存在實驗室內(nèi)，本文所用的培養(yǎng)液為MES培養(yǎng)基[19]。

2.2 野生型長紫菜葉狀體的培養(yǎng)

取少量的長紫菜自由絲狀體，用消毒刀片將其切碎，隨后被配成絲狀體切斷的懸浮液，后者被均勻地鋪灑于培養(yǎng)皿(Ф=9 cm)內(nèi)，培養(yǎng)條件：溫度(19±1)℃，光照密度20 μmol/(m2·s)，光周期10L∶14D，每隔5 d更換一半的新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)2周后，將光照強度增加至40 μmol/(m2·s)，其他培養(yǎng)條件不變。待絲狀體鋪滿培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)條件調(diào)整為：溫度(23±1)℃，光照密度10 μmol/(m2·s)，光周期8L∶16D。數(shù)周后，挑選已發(fā)育成熟的膨大藻絲，放入培養(yǎng)瓶內(nèi)(250 mL)進行充氣培養(yǎng)，并放入4～6根尼龍單絲供殼孢子附著。待尼龍絲上附著一定量的殼孢子后，將它們轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶(250 mL)內(nèi)充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(19±1)℃，光照密度50 μmol/(m2·s)，光周期10L∶14D。當殼孢子萌發(fā)體的長度長至1 cm左右，將它們從尼龍單絲上刮下，繼續(xù)充氣培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后，隨機取20棵葉狀體進行培養(yǎng)，每隔5 d測量一次它們的長度和鮮質(zhì)量，同時進行拍照記錄，并更換一半的培養(yǎng)液。

2.3 葉狀體的誘變處理與色素變異體分離

選擇健康的長紫菜殼孢子萌發(fā)體(體長3～4 cm)作為誘變材料，以60Co-γ射線為誘變源，輻照劑量分設(shè)1 000、1 400和1 800 Gy 3組。輻照后的萌發(fā)體先在黑暗下培養(yǎng)24 h，再恢復(fù)光照進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(19±1)℃，光照密度50 μmol/(m2·s)，光周期10L∶14D。培養(yǎng)3～4周后，從每個輻照組中隨機取3棵葉狀體，從基部到梢部每隔1 cm統(tǒng)計10個視野(×20)內(nèi)的色素變異細胞塊數(shù)；同時，用熒光倒置顯微鏡(Nikon Eclipse 90i，日本尼康公司)拍照并記錄色素變異細胞塊的類型。培養(yǎng)一段時間后，將含色素變異細胞塊的葉狀體酶解，分離出單個變異細胞，進行體外植株再生培養(yǎng)，方法同文獻[19]。培養(yǎng)4周后，從中挑選具有明顯生長優(yōu)勢的單顏色變異體，進行單株充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

進一步分析實驗組和對照組酒樣的質(zhì)量差別，發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)在放香的純正度、入口柔和度、酒體協(xié)調(diào)度、醇厚度、后口干凈程度5個方面，對這5個分項的評分進行了系統(tǒng)性分析，結(jié)果見圖2。

2.4 優(yōu)良品系的純系分離與F1葉狀體的生長特性分析

當單色變異體成熟時，利用它的單性生殖獲得其絲狀體[20]，即為新品系的遺傳純合絲狀體。當新品系的自由絲狀體藻落長到一定大小時，將其用家用粉碎機粉碎后接種于文蛤殼表面上，培養(yǎng)成貝殼絲狀體，方法同文獻[21]。待貝殼表面的絲狀體長滿后，培養(yǎng)液更換為含氮磷比例為1∶10的滅菌海水，同時，培養(yǎng)條件調(diào)整為：溫度(29±1)℃，光照密度50 μmol/(m2·s)，光周期8L∶16D。當貝殼絲狀體成熟后，再將成熟的單個貝殼絲狀體置于(19±1)℃下進行充氣刺激培養(yǎng)，并放入尼龍單絲供殼孢子附著，讓殼孢子萌發(fā)成F1葉狀體。當葉狀體日齡達30 d時，隨機取20棵葉狀體，每隔5 d測量一次它們的長度和鮮質(zhì)量，同時拍照記錄藻體的形態(tài)和更換一半的培養(yǎng)液。葉狀體的絕對生長率和相對生長率計算公式同文獻[22]，分別如下式(1)和(2)所示：

K1=(L-L0)/t，

(1)

K2=(lnN-lnN0)/t，

(2)

式中，L、N代表某一次葉狀體長度的測量值，N0、L0則為上一次葉狀體長度的測量值，單位是cm，t代表前后兩次測量的時間間隔，單位為d。

2.5 F1葉狀體的活體吸收光譜和主要色素蛋白含量測定

取培養(yǎng)45 d的F1葉狀體，用分光光度計(UV-2600，日本島津公司)分別測定葉狀體在350～750 nm波長下的活體吸收光譜曲線和主要光合色素含量。葉狀體在不同波長下的吸光值測定方法同文獻[23]，根據(jù)吸光值用Origin8.5軟件再繪制出吸收光譜曲線；葉綠素a含量的測定方法同文獻[24]，藻紅蛋白和藻藍蛋白含量的測定方法同文獻[25]。

2.6 葉狀體的厚度測量

2.7 殼孢子放散量統(tǒng)計

將各品系成熟的貝殼絲狀體，單個放入含50 mL培養(yǎng)液的一次性塑料杯子中進行充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(19±1)℃，光照密度50 μmol/(m2·s)，光周期10L∶14D。每個品系設(shè)置3個平行組。每天中午12點后將杯中的孢子水攪拌均勻后倒入培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)中，靜置培養(yǎng)24 h待殼孢子附著后，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計20個視野(10倍)內(nèi)的殼孢子數(shù)量。當殼孢子開始放散后連續(xù)計數(shù)20 d以獲得單個貝殼的殼孢子放散總量。殼孢子的日放散量計算公式：

殼孢子日放散量=

每個視野內(nèi)殼孢子平均數(shù)，

(3)

式中，π為圓周率，取值為3.14；10×10倍顯微鏡的視野直徑為22 mm。

3 結(jié)果

3.1 葉狀體誘變效果與色素突變體分離

長紫菜野生型品系的葉狀體經(jīng)不同劑量的60Co-γ射線輻照處理后，再培養(yǎng)2周，在顯微鏡下可觀察到葉狀體上呈點狀分布的各類色素變異細胞，它們呈不規(guī)則狀鑲嵌于正常體細胞之間。培養(yǎng)2～3周后，色素變異細胞逐漸分裂成大小不一的色素變異細胞塊(圖版Ⅰ)。

如圖版Ⅰ所示，野生型細胞與色素變異細胞塊間有明顯的界限，變異細胞塊多為棗紅、磚紅、淺紅紫、紫紅、紅褐、淺桔紅、淺桔黃等顏色，少數(shù)為草綠、黃綠和灰褐色。如表1所示，對照組的葉狀體上未觀察到色素變異細胞塊，而輻照組的色素變異細胞塊數(shù)隨著輻照劑量的增加而逐漸增加。如表2所示，同一個葉狀體中不同部位的色素變異細胞塊出現(xiàn)的頻率是不同的，從基部到梢部，其變異頻率逐漸增加。

表1 長紫菜野生型品系(PD-WT)的葉狀體經(jīng)不同劑量的60Co-γ射線輻照后再培養(yǎng)25 d時出現(xiàn)的色素變異細胞塊的種類和數(shù)量Tab.1 The types and numbers of the color-mutated cell-clusters appeared in the blades of the wild-type strain (PD-WT) in Pyropia dentata after being irradiated by 60Co-γ ray in different doses and cultured for 25 days

表2 經(jīng)不同劑量的60Co-γ射線輻照處理的長紫菜野生型品系(PD-WT)葉狀體再培養(yǎng)25 d后在不同部位處出現(xiàn)的色素變異細胞塊數(shù)量Tab.2 Numbers of color-mutated cell-clusters appeared at different parts of Pyropia dentata blades of the wide-type strain(PD-WT) after being irradiated by 60Co-γ ray in different doses and cultured for 25 days

含色素變異細胞的葉狀體被酶解后獲得了大量的體細胞，后者經(jīng)30多天的再生培養(yǎng)長成了葉狀體，從中分離出單色的色素變異體，待它們長大后，再篩選出一顆生長優(yōu)勢最明顯的變異體，它的顏色呈褐紅色，基部偏綠，梢部偏紅，生長很快。當它成熟時，發(fā)生單性生殖產(chǎn)生了純合絲狀體，被命名為PD-5品系。

3.2 選育品系F1葉狀體的生長特性分析

PD-5品系的殼孢子萌發(fā)體的藻體顏色非常一致，藻體基部偏綠，而梢部偏紅，與最初的母體一致，其性別全為雌性。PD-5品系的藻體為細長型，較PD-WT品系稍寬(圖版Ⅱ)。

如圖1所示，相同日齡的F1葉狀體，PD-5品系的平均體長遠大于PD-WT品系。日齡30 d的葉狀體，PD-5品系的平均體長達8.95 cm，是PD-WT品系的5.93倍。日齡60 d后，PD-WT品系的葉狀體就進入了緩慢生長期，而PD-5品系仍處于快速生長期。日齡70 d的葉狀體，PD-5品系的平均體長已達117.42 cm，是PD-WT品系的4.32倍。由表3可知，PD-5品系的葉狀體絕對生長率在日齡45～50 d時出現(xiàn)最大值，為3.76 cm/d，而PD-WT品系的最大絕對生長率卻出現(xiàn)在35～40 d，僅為

1.045 cm/d。培養(yǎng)的第30～45 d期間，PD-5品系的葉狀體特定生長率沒有比PD-WT品系顯示出優(yōu)勢，但是，培養(yǎng)45 d之后，PD-5品系的相對生長率就逐漸超過PD-WT品系，尤其是在60 d之后兩者的差異就更加明顯。

圖1 長紫菜選育品系(PD-5)與野生型品系(PD-WT)F1葉狀體的生長曲線Fig.1 The growth curves of F1 gametophytic blade of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) in Pyropia dentata

表3 長紫菜選育品系(PD-5)與野生型品系(PD-WT)F1葉狀體的生長率Tab.3 Growth rates of the F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) in Pyropia dentata

由圖2可知，在生長前期(30 d之前)，PD-5品系的葉狀體平均鮮質(zhì)量并未表現(xiàn)出明顯生長優(yōu)勢；35 d后，PD-5品系的葉狀體平均鮮質(zhì)量進入快速生長期，而PD-WT品系仍處于緩慢增長期。日齡70 d時，PD-5品系的單棵葉狀體平均鮮質(zhì)量為1.98 g，是PD-WT品系的9.81倍。

圖2 長紫菜選育品系(PD-5)與野生型(PD-WT)F1葉狀體的平均單棵鮮質(zhì)量Fig.2 The fresh weight of per F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) in Pyropia dentata

圖3 日齡45 d的長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)F1葉狀體的活體吸收光譜曲線Fig.3 In vivo absorption spectra of F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) after being cultured for 45 days in Pyr-opia dentata

3.3 選育品系及野生型品系F1葉狀體的活體吸收光譜特性和主要色素蛋白含量

在350～750 nm之間，D-5與PD-WT品系的葉狀體活體吸收光譜曲線均出現(xiàn)5個明顯的吸收峰，分別被標為P1、P2、P3、P4和P5，但PD-5品系的各吸收峰的峰值均顯著高于PD-WT品系(圖3)。

由表4可知，日齡45 d的PD-5品系葉狀體的葉綠素a(Chla)含量為8.41 mg/g，比PD-WT品系增加了25.71%；PD-5品系的藻紅蛋白(PE)和藻藍蛋白(PC)含量分別是PD-WT品系的2.87倍和1.29倍，其總藻膽蛋白(PE+PC)含量比PD-WT品系增加了104.44%。

表4 日齡為45 d的長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)F1葉狀體的Chl a、PE、PC以及總藻膽蛋白(PE+PC)的含量(n=3)Tab.4 Contents of Chl a， PE， PC， Phycobiliprotein in F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain(PD-WT) after being cultured for 45 days in Pyropia dentata (n=3)

注：**表示差異極其顯著，(P<0.01，t-test)，* 表示差異顯著(P<0.05，t-test)，下同。

3.4 F1葉狀體的厚度

日齡45 d的葉狀體得橫切面觀察發(fā)現(xiàn)，從葉狀體的梢部到基部，其藻體厚度逐漸增加。PD-5品系葉狀體的平均厚度為26.79 μm，比野生型品系薄了35.04%，獨立樣本T檢驗顯示其差異極顯著(見表5)。

表5 日齡為45 d的長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)的F1葉狀體厚度(n=3)Fig.5 Thickness of different parts of F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) after being cultured for 45 days in Pyropia dentata (n=3)

3.5 選育品系的殼孢子放散量

自殼孢子放散開始連續(xù)統(tǒng)計20 d的殼孢子放散量后發(fā)現(xiàn)，在20 d 中，PD-5品系出現(xiàn)了3個大的放散高峰，放散量分別為86.70萬、46.28萬、65.16 萬個/貝殼，均出現(xiàn)在前7天內(nèi)；而PD-WT品系在前7天僅出現(xiàn)了一個大的放散高峰，放散量僅為56.69 萬個/貝殼(圖4)。由表6知，PD-5品系連續(xù)20 d的殼孢子放散總量為421.16 萬個/貝殼，是野生型品系的2.19倍。

圖4 長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)在19℃下連續(xù)放散20 d的殼孢子日放散量Fig.4 Numbers of conchospores daily resealed from the improved strains (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) at 19oC during 20 days in Pyropia dentata

表6 長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)在19℃下連續(xù)放散20 d的殼孢子放散總量Tab.6 Total numbers of conchospores released from the improved strains (PD-5) and the wide-type strain (PD-WT) at 19℃ during 20 days of conchospore-releasing in Pyropia dentata

4 討論

目前，國內(nèi)外在紫菜人工誘變育種的研究中，使用較多的誘變劑是化學(xué)誘變劑MNNG[26—30]和物理誘變劑γ-射線[24，31—35]。γ-射線的作用機理是破壞細胞內(nèi)DNA或mRNA分子堿基對間的化學(xué)鍵，使堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或置換，從而達到變異效果[31]，它以使用方便，干凈，穿透力強，誘發(fā)突變率高，周期短等優(yōu)點而廣泛使用[31—35]。我國藻類學(xué)者利用60Co-γ射線通過輻照處理壇紫菜和條斑紫菜的不同生長階段(絲狀體、葉狀體、原生質(zhì)體)，均獲得了良好的變異效果，已分離出了具有生長優(yōu)勢的色素突變體[31—33，35]。

本試驗選用60Co-γ射線輻照處理長紫菜葉狀體，也獲得了良好的變異效果。在60Co-γ射線輻照劑量方面，條斑紫菜的最適劑量為500 Gy[34]，壇紫菜的為1 100 Gy[35]，但本實驗的結(jié)果表明，1 800 Gy組出現(xiàn)的變異細胞塊最多。在變異細胞塊的種類上，60Co-γ射線對野生型壇紫菜、條斑紫菜及長紫菜的變異效果差異不大，均是以紅色型的變異細胞塊偏多。

在生產(chǎn)中，衡量一種紫菜栽培品系的優(yōu)劣主要取決于其葉狀體的生長、主要色素和色素蛋白含量以及殼孢子放散量等。與長紫菜野生型品系相比，PD-5品系具有生長快、成熟晚和藻體薄等優(yōu)勢。另外，3種主要光合色素和色素蛋白含量的高低對商品紫菜餅的質(zhì)量好壞起決定作用[36]，因此，主要光合色素較高的PD-5品系比PD-WT的品質(zhì)更好。生產(chǎn)上，進行殼孢子附網(wǎng)采苗時，放散量的大小和是否集中放散將直接影響采苗效果的好壞。與PD-WT品系相比，PD-5品系不僅總放散量增加了二倍，而且放散量集中，3個主要放散高峰均出現(xiàn)在頭7 d，如果在生產(chǎn)中應(yīng)用此品系，它能更早更多地采足殼孢子，早日下海栽培。由此可見，本文分離出來的PD-5品系有望被培育成具有優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)且適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的長紫菜新品種。

[1] Sutherland J E， Lindstrom S C， Nelson W A， et al. A new look at an ancient order: generic revision of the Bangiales (Rhodophyta) [J]. Journal of Phycology， 2011， 47(5): 1131-1151.

[2] 張學(xué)成， 秦松， 馬家海， 等. 海藻遺傳學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2005: 190-192.

Zhang Xuecheng， Qin Song， Ma Jiahai， et al. The Genetics of Marine Algae[M]. Beijing: China Agriculture Press， 2005: 190-192.

[3] 曾呈奎， 張峻甫. 我國的紫菜與紫菜養(yǎng)殖[J]. 生物學(xué)通報， 1956(3): 29-33.

Zeng Chengkui， Zhang Junfu. The ChinesePorphyraand seaweed cultivation[J]. Biological Bulletin， 1956(3): 29-33.

[4] 張德瑞， 鄭寶福. 中國的紫菜及其地理分布[J]. 海洋與湖沼， 1962， 4(3/4): 183-188.

Zhang Derui， Zheng Baofu. The ChinesePorphyraand their geographical distribution[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 1962， 4(3/4): 183-188.

[5] King N G. Culture studies ofPorphyradentataandP.pseudolinearis(Bangiales， Rhodophyta)， two dioecious species from Korea[J]. Hydrobiologia， 1999(398/399): 127-135.

[6] Notoya M， Kikuchi N， Matsuo M， et al. Culture studies of four species ofPorphyra(Rhodophyta) from Japan[J]. Nippon Suisan Gakkaishi， 1993， 59(3): 431-436.

[7] 許俊斌， 陳偉洲， 宋志民， 等. 不同培養(yǎng)條件對長紫菜葉狀體生長及生理響應(yīng)的研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2013， 37(9): 1319-1327.

Xu Junbin， Chen Weizhou， Song Zhimin， et al. Effects of different culture conditions on growth and physiological response ofPorphyradentatathallus[J]. Journal of Fisheris of China， 2013， 37(9): 1319-1327.

[8] 嚴興洪， 馬少玉. 壇紫菜抗高溫品系的篩選[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2007， 31(1): 112-119.

Yan Xinghong， Ma Shaoyu. Selection of a high-temperature resistant strain ofPorphyrahaitanensis[J]. Journal of Fisheris of China， 2007， 31(1): 112-119.

[9] 陳昌生， 紀德華， 謝潮添， 等. 壇紫菜耐高溫品系選育及經(jīng)濟性狀的初步研究[J]. 海洋學(xué)報， 2008， 30(5): 100-106.

Chen Changsheng， Ji Dehua， Xie Chaotian， et al. Preliminary study on selecting the high temperature resistance strains and economic traits ofPorphyrahaitanensis[J]. Haiyang Xuebao， 2008， 30(5): 100-106.

[10] 呂峰， 嚴興洪， 劉長軍， 等. 壇紫菜耐高溫品系的選育與海區(qū)中試[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 2010， 19(4): 457-462.

Lv Feng， Yan Xinghong， Liu Changjun， et al. Selection of a high-temperature tolerant strain ofPorphyrahaitanensisand its cultivation in sea area[J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2010， 19(4): 457-462.

[11] 嚴興洪， 陳敏. 壇紫菜耐低鹽優(yōu)良品系的篩選[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 2008， 17(3): 316-320.

Yan Xinghong， Chen Min. Selection of low-salinity resistant improved varieties inPorphyrahaitanensis(Bangiales， Rhodophyta)[J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2008， 17(3): 316-320.

[12] 柳佩娟， 紀德華， 謝潮添， 等. 壇紫菜耐低氮磷品系選育的研究[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2009， 14(2): 15-20.

Liu Peijuan， Ji Dehua， Xie Chaotian， et al. Study on selection of low N and P resistant strains inPorphyrahaitanensis[J]. Journal of Jimei University (Natural Science)， 2009， 14(2): 15-20.

[13] 宋武林. 壇紫菜優(yōu)良品系“申福1號”苗種培育技術(shù)研究[J]. 南方水產(chǎn)， 2006， 2(4): 19-23.

Song Wulin. A research on the technique of conchosporelings about the premium strain of “Shenfu No. 1”inPorphyrahaitanensis[J]. South China Fisheries Science， 2006， 2(4): 19-23.

[14] 王長青， 嚴興洪， 黃林彬， 等. 壇紫菜優(yōu)良品系“申福2號”的特性分析與海區(qū)中試[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2011， 35(11): 1658-1667.

Wang Changqing， Yan Xinghong， Huang Linbin， et al. Characterization of an improved strain (SF-2) ofPorphyrahaitanensis(Bangiales， Rhodophyta) and its pilot cultivation in mariculture farm[J]. Journal of Fisheries of China， 2011， 35(11): 1658-1667.

[15] 吳宏肖， 嚴興洪， 宋武林， 等. 壇紫菜與Pyropiaradi種間雜交重組優(yōu)良品系的選育與特性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2014， 38(8): 1079-1088.

Wu Hongxiao， Yan Xinghong， Song Wulin， et al. Selection and characterization of an improved strain produced by genetic recombinant of interspecific hybridization betweenPyropiahaitanensisandPyropiaradi[J]. Journal of Fisheries of China， 2014， 38(8): 1079-1088.

[16] 何培民， 秦松， 嚴曉軍， 等. 海藻生物技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2007: 86-98.

He Peimin， Qin Song， Yan Xiaojun， et al. Seaweed Biological Technology and its Application[M]. Beijing: Chemical Industry Press， 2007: 86-98.

[17] 梁紅. 植物遺傳與育種[M]. 廣州: 廣東高等教育出版社， 2002: 197-206.

Liang Hong. Plant Genetics and Breeding[M]. Guangzhou: Guangdong Higher Education Press， 2002: 197-206．

[18] 全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站. 2014水產(chǎn)新品種推廣指南[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2014: 146-164.

National Fisheries Extension Center. 2014 Promotion of New Varieties of Aquatic Guide [M]. Beijing: Chinese Agriculture Press， 2014: 165-181.

[19] 王素娟， 張小平， 徐志東， 等. 壇紫菜營養(yǎng)細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究Ⅰ[J]. 海洋與湖沼， 1986， 17(3): 217-221.

Wang Sujuan， Zhang Xiaoping， Xu Zhidong， et al. A study on the cultivation of the vegetative cells and protoplasts ofP.haitanensisⅠ[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 1986， 17(3): 217-221.

[20] 嚴興洪， 李琳， 陳俊華， 等. 壇紫菜的單性生殖與遺傳純系分離[J]. 高技術(shù)通訊， 2007， 17(2): 205-210.

Yan Xinghong， Li Lin， Chen Junhua， et al. Parthenogenesis and isolation of genetic pure strains inPorphyrahaitanensis(Bangiales， Rhodophyta)[J]. Chinese High Technology Letters， 2007， 17(2): 205-210．

[21] 嚴興洪， 梁志強， 宋武林， 等. 壇紫菜人工色素突變體的誘變與分離[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2005， 29(2): 166-172.

Yan Xinghong， Liang Zhiqiang， Song Wulin， et al. Induction and isolation of artificial pigmentation mutants inPorphyrahaitanensisChang et Zheng (Bangiales， Rhodophyta)[J]. Journal of Fisheries of China， 2005， 29(2): 166-172.

[22] Stein J R. Handbook of Phycological Methods: Culture Methods and Growth Measurements[M]. London: Cambridge University Press， 1973: 289-311.

[23] Aruga Y， Miura A.Invivoabsorption spectra and pigment contents of the types of color mutants ofPorphyrapurpurea(Rhodophyta)[J]. Japanese Journal of Phycology， 1984， 32(3): 243-250.

[24] Kato M， Aruga Y. Comparative studies on the growth and photosynthesis of the pigmentation mutants ofPorphyrayezoensisin laboratory culture[J]. Japanese Journal of Phycology， 1984， 32: 333-347.

[25] 高洪峰. 不同生長期壇紫菜中藻膽蛋白的含量變化[J]. 海洋與湖沼， 1993， 24(6): 645-648.

Gao Hongfeng. The variation in the contents of phycobiliproteins fromPorphyrahaitanensiscollected in different growing stages[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 1993， 24(6): 645-648.

[26] Yan X H， Aruga Y. Induction of pigmentation mutants by treatment of monospore germlings with NNG inPorphyrayezoensisUeda (Bangiales， Rhodophyta)[J]. Algae， 1997， 12(1): 39-54.

[27] 嚴興洪， 田中次郎， 有賀佑勝. 條斑紫菜色彩突變體的誘導(dǎo)， 分離和特性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2000， 21(3): 221-228.

Yan Xinghong， Tanaka Jiro， Aruga Yusho. Isolation and characterization of pigmentation mutants inPorphyrayezoensisUeda (Bangiales， Rhodophyta)[J]. Journal of Fisheries of China， 2000， 21(3): 221-228.

[28] Yan X H. Studies on color type variants from mutagenized protoplasts ofPorphyrahaitanensisChang et Zheng &P.yezoensisUeda (rhodophycease)[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology， 1993， 11(3): 235-244.

[29] Yan X H， Aruga Y. Genetic analysis of artificial pigmentation mutants inPorphyrayezoensisUeda (Bangiales， Rhodophyta) [J]. Phycological Research， 2000， 48(3): 177-187.

[30] 李永斌， 左正宏， 李博文， 等. MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)誘變壇紫菜原生質(zhì)體的初步研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2006， 45(3): 400-403.

Li Yongbin， Zuo Zhenghong， Li Bowen， et al. Studies on protoplasts morphological change and growth ofPorphyrahaitanensistreated with mutagen MNNG[J]. Journal of Xiamen University (Natural Science)， 2006， 45(3): 400-403.

[31] 匡梅， 許璞， 王素娟. γ-射線對條斑紫菜和壇紫菜誘變作用的初步研究[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報， 1997， 6(4): 241-245.

Kuang Mei， Xu Pu， Wang Sujuan. A preliminary study of the mutagenesis of γ-rays onPorphyrayezoensisandP.haitanensis[J]. Journal of Shanghai Fishries University， 1997， 6(4): 241-245.

[32] 王素娟， 馬凌波， 許璞， 等.60Co-γ射線誘變條斑紫菜絲狀體的研究[J]. 海洋科學(xué)， 1999(4): 43-46.

Wang Sujuan， Ma Lingbo， Xu Pu， et al. Study on using gamma-ray to induce mutation in conchocelis ofPorphyrayezoensis[J]. Marine Sciences， 1999(4): 43-46.

[33] 梁志強. 壇紫菜遺傳育種的初步研究[D]. 上海: 上海水產(chǎn)大學(xué)， 2004: 10-22.

Liang Zhiqiang. Primary study on genetics and breeding ofPorphyrahaitanenis[D]. Shanghai: Shanghai Fisheries University， 2004: 10-22.

[34] 紀德華， 陳昌生， 鄭偉剛， 等.60Co-γ射線輻照壇紫菜葉狀體及單克隆培養(yǎng)的研究[J]. 臺灣海峽， 2005， 24(2): 171-177.

Ji Dehua， Chen Changsheng， Zheng Weigang， et al. Study of60Co-γ irradiation and monoclone culture in thallus ofPorphyrahaitanensis[J]. Journal of Oceanography in Taiwan Strait， 2005， 24(2): 171-177.

[35] 嚴興洪， 張淑娟， 黃林彬.60Co-γ射線對條斑紫菜 (Porphyrayezoensis) 的誘變效果與色素突變體分離[J]. 海洋與湖沼， 2009， 40(1): 56-61.

Yan Xinghong， Zhang Shujuan， Huang Linbin. Induction and isolation of pigmentation mutants ofPorphyrayezoensisUeda (Bangiales， Rhodophyta) by60Co-γ ray irradiation[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 2009， 40(1): 56-61.

[36] 紀德華， 謝潮添， 周修史， 等. 福建沿海野生壇紫菜主要品質(zhì)性狀分析[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2011， 16(6): 401-406.

Ji Dehua， Xie Chaotian， Zhou Xiushi， et al. Analysis of the major quality traits in the wildPorphyrahaitanensisof Fujian coast[J]. Journal of Jimei University (Natural Science)， 2011， 16(6): 401-406.

Isolation and characterization of an improved strain of Pyropia dentata (Bangiales， Rhodophyta) after being irradiated by60Co-γ ray

Li Shuping1， Yan Xinghong1，2

(1.CollegeofFisheriesandLifeSciences，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China; 2.KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResources，ShanghaiOceanUniversity，MinistryofEducation，Shanghai201306，China)

The young gametophytic blades ofPyropiadentata， developed from conchospores of the wild-type strain (PD-WT)， were treated with60Co-γ ray to induce mutation in the experiment. After being cultured for 4 weeks， there were many color-mutated cell clusters showing bright red， red brown， red orange and yellow green in the treated blades. The results showed that the percentage of the colored-mutated cell-clusters increased as increasing of the irradiation dose and from the base to the tip of the blades. Single color-mutated cells were isolated enzymatically from the color-mutated blades and were regenerated into blades. An improved strain named asPD-5 strain with the growth advantages was selected from the regenerated blades. In the growth of the blades， the maximum and average absolute growth rates of this improved strain were 3.76 cm/d and 2.71 cm/d， which were 3.60 and 4.22 times that of thePD-WTstrain， respectively， during culture from 30 to 70 days. The mean length of F1gametophytic blades ofPD-5 strain was 117.42 cm which was 4.32 times that of thePD-WTstrain after being cultured for 70 days. The contents of Chlaand phycobiliprotein of thePD-5 strain were 8.41 mg/g and 97.07 mg/g， respectively， increasing by 25.71% and 104.44% in contrast with that of thePD-WT，respectively. The mean thickness of the 45-day-old blades of thePD-5 was 26.79 μm，decreasing by 35.04% in contrast with that of thePD-WT. The total numbers of the conchospores released from thePD-5 strain was 421.16×104per shell，which was 2.19 times that of thePD-WTstrain. The aboved results confirmed that thePD-5 strain was characterized by faster growth，higher contents of photosynthetic pigments，larger amount of releasing conchospores than the wild-type strain. Therefore，the improved strainPD-5 had great potential to be applied in commercial cultivation as a new strain．

Pyropiadentata; blades;60Co-γray; pigmentation mutation; regenerated blades; improved strain

圖版Ⅰ 經(jīng)60Co-γ射線輻照后在長紫菜野生型品系(PD-WT)葉狀體上形成的不同顏色變異色塊顯微照片PlateⅠ Micrographs of the color-mutated cell-clusters appeared in the gametophytic blades of the wild-type strain (PD-WT) in Pyropia dentata after being irradiated with 60Co-γ ray1～9分別為棗紅色、磚紅色、紫紅色、暗紅紫色、黃褐色、灰褐色、草綠色、淺桔黃色和淺桔紅色的色素變異細胞塊。箭頭所指處為上述命名的色素變異細胞塊 (圖中標尺為50 μm)1-9. Reddish orange，bright red，red purple，light purple red，yellow brown，grey brown，bright green，yellow orange and light red orange color-mutated cell-clusters (arrowheads)，respectively (Bar=50 μm)

圖版Ⅱ 長紫菜選育品系(PD-5)和野生型品系(PD-WT)的F1葉狀體生長比較Plate Ⅱ Comparison of the growth of F1 gametophytic blades of the improved strain (PD-5) and the wide-type (PD-WT) strain in Pyropia dentate 1～3.分別培養(yǎng)35、45和55d的長紫菜野生型品系(PD-WT)的F1葉狀體；4～6. 分別培養(yǎng)35、45、55d的長紫菜選育品系(PD-5)的F1葉狀體(圖中標尺為5 cm)1-3. The F1 gametophytic blades of the PD-WT strain，after being cultured for 35，45 and 55 days，respectively； 4-6. The F1 gametophytic blades of the PD-5 strain，after being cultured for 35，45 and 55 days，respectively(Bar=5 cm)

2015-04-29；

2015-06-23。

國家高科技研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2012AA10A411)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31072208)；農(nóng)業(yè)部公益性專項(200903030)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2013GB2C220537); 上海市科委重點科技攻關(guān)項目(10391901100)；國家海洋局公益專項(201105008, 201105023)；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目資助；福建省省長專項基金(2014S1477-10)。

李淑平(1989—), 女, 山東省濱州市人,從事海藻遺傳育種研究。E-mail:lishuping29@126.com

*通信作者：嚴興洪, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事海藻遺傳育種, 海藻生理生態(tài)與分子生物學(xué)。E-mail:xhyan@shou.edu.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.007

S917.3

A

0253-4193(2015)10-0069-11

李淑平，嚴興洪.60Co-γ射線輻照對長紫菜的誘變效果及優(yōu)良品系分離與特性分析[J].海洋學(xué)報，2015，37(10)：69—79，

Li Shuping， Yan Xinghong. Isolation and characterization of an improved strain ofPyropiadentata(Bangiales， Rhodophyta) after being irradiated by60Co-γ ray[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(10)：69—79， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.007