松江鱸(Trachidermus fasciatus)泛素結(jié)合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析

陳學(xué)昭，張雷，于珊珊，畢彩紅，劉春影，祝茜*

(1.山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院，山東 威海 264209)

松江鱸(Trachidermus fasciatus)泛素結(jié)合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析

陳學(xué)昭1，張雷1，于珊珊1，畢彩紅1，劉春影1，祝茜1*

(1.山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院，山東 威海 264209)

泛素結(jié)合酶(UbcE2)是蛋白泛素化過程中所必需的酶，在泛素轉(zhuǎn)移和底物的特異性識別方面發(fā)揮著重要的作用。本實驗利用RACE技術(shù)克隆獲得了全長為993 bp的松江鱸泛素結(jié)合酶E2-D2基因cDNA序列(命名為TfUbcE2-D2)，其開放閱讀框為444 bp，編碼147個氨基酸。通過SMART預(yù)測得知，TfUbcE2-D2含有一個UBCc結(jié)構(gòu)域。同源比對結(jié)果表明該基因與其他物種的同源性為92.31%。實時熒光定量PCR顯示，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸各組織，在腎臟中的相對表達量最高，其次為鰓。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)刺激后，TfUbcE2-D2在血液、脾臟、肝臟和鰓中表達均上調(diào)，其中，脾臟和鰓中的表達量上調(diào)約40倍。由以上實驗結(jié)果推測，TfUbcE2-D2可能參與松江鱸的先天免疫防御。

泛素結(jié)合酶；松江鱸；基因克?。环翘禺愋悦庖?/p>

1 引言

松江鱸(Trachidermusfasciatus)隸屬于鲉形目，杜父魚科，松江鱸魚屬 ，曾廣泛分布于我國沿海，但由于環(huán)境的破壞及人為因素干擾，其種群數(shù)量銳減，于1988年被列為國家二級保護動物。為恢復(fù)其種群數(shù)量，除對其棲息地的保護外還需要進行人工養(yǎng)殖，而在人工養(yǎng)殖中的各種刺激勢必會引起各種疾病的出現(xiàn)和蔓延。為此，本實驗室著手研究松江鱸的免疫學(xué)機制，以期為松江鱸的養(yǎng)殖及保護提供一定的參考依據(jù)。

泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway，UPP )，發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代末，是介導(dǎo)機體蛋白降解的一個重要機制[1]。通過降解和修飾蛋白，UPP參與生物體多種生理生化過程，表現(xiàn)出功能的多樣性[2—3]。最新研究表明，UPP還參與無脊椎動物免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)[4]。組成UPP途徑的成分主要有：泛素(Ubiquitin，Ub) 、泛素活化酶(Ub-Activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(Ub-Conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(Ub-Ligating enzyme，E3)、26S蛋白酶體(26S Proteasomes)和去泛素化酶(DUBs)。

泛素結(jié)合酶E2(UbcE2)通過硫酯鍵與活化的泛素相連，在E3的作用下，泛素與靶蛋白形成泛素-蛋白復(fù)合體，UbcE2也可以直接把泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上。所有的UbcE2都含有一個保守的、大約包含150個氨基酸的核心結(jié)構(gòu)域(Ubcc)。目前發(fā)現(xiàn)的E2有50余種，推測其多樣性與對靶細胞的特異性選擇有關(guān)[5]。 盡管有研究表明UPP參與了無脊椎動物的先天免疫，但是否參與脊椎動物的先天免疫，目前未見報道。 本文以松江鱸為研究對象，通過基因克隆成功獲得了松江鱸泛素結(jié)合酶E2的亞型D2(命名為TfUbcE2-D2)的cDNA全長，進一步采用熒光實時定量PCR手段，分析TfUbcE2-D2 mRNA的組織分布以及鰻弧菌(Vibrioanguillarum)刺激后其表達模式變化，探討泛素結(jié)合酶E2在松江鱸先天免疫中的作用，為進一步研究泛素結(jié)合酶在魚類免疫方面的作用打下了一定的基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗動物

松江鱸(體質(zhì)量15～23 g，9～10月齡)取自山東文登埠口松江鱸自然保護區(qū)，實驗前將其飼養(yǎng)于12 ～14℃循環(huán)海水中，適應(yīng)一周后，挑取正常健康的個體進行試驗。

2.1.2 主要儀器和試劑

7300實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)；RNA提取試劑盒(EZNATMTotal RNA Kit Ⅱ)產(chǎn)自美國Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse TranscriptaseM-MLV)、RNA酶抑制劑、SYBR○RPremix Ex TaqTM試劑盒為TaKaRa Biotechnology產(chǎn)品(日本)。

2.2 實驗方法

2.2.1 總RNA提取和cDNA合成

(1)實驗處理

將適應(yīng)后健康的松江鱸分成實驗組和對照組(各50條)：① 對照組：腹腔注射50 μL PBS緩沖液。② 鰻弧菌刺激組：腹腔注射鰻弧菌0.1 mL(約108/mL)。兩組均于刺激后2 h、6 h、12 h、24 h用三卡因甲基磺酸鹽(Sigma，St. Louis，MO，USA)麻醉取樣(每個時間點每組取5尾)，取出的各組織器官(血液、心臟、肝臟、鰓、胃、腸、皮膚、腎臟、脾臟和腦)于液氮中速凍，然后分裝放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)EZNATMMicroElute○Rtotal RNA Kit Ⅱ試劑盒(QMEGA，USA)的操作說明，提取各個樣品的總mRNA。cDNA合成參照CLONTECH公司SMART(Switching mechanism at 5′ end of RNA template)的指導(dǎo)說明。PCR所用引物為Smart F、Oligo-anchor R，引物序列見表1。

2.2.2 TfUbcE2-D2 cDNA全長克隆

由NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中查找已發(fā)表的如下魚類U bcE2-D2的cDNA基因序列：羅非魚(XM_003447621.2Oreochromisniloticus)、斑馬宮麗魚(XM_004552029.1Maylandiazebra)、半滑舌鰨(XM_008327233.1Cynoglossussemilaevis)、青鳉(XM_004085735.1Oryziaslatipes)、紅鰭東方鲀(XM_003978490.1Takifugurubripes)、劍魚(XM_005811259.1Xiphophorusmaculatus)、斑馬魚(NM_199952.1Daniorerio)、大西洋鮭(BT056835.1Salmosalar)、胡瓜魚(BT074727.1Osmerusmordax)和藍鯰魚(GU588028.1Ictalurusfurcatus)，用DNAman進行多序列比對，并用Primer Premier 5.0在保守序列區(qū)設(shè)計簡并引物(TfR1、TfF1，見表1)。以松江鱸肝臟cDNA為模板進行PCR，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)后，72℃總延伸10 min。將純化產(chǎn)物進行克隆測序獲得中間片段。根據(jù)獲得序列設(shè)計特異性引物TfF2、TfR2分別與3′ anchor R、 5′ primer 配對進行RACE克隆，得到5′端和3′端序列。利用Clustal W、DNAman、BioEdit等生物分析軟件并結(jié)合人工校對，對TfUbcE2-D2的5端、中間序列和3′端進行拼接，得到目的基因cDNA全長序列。

2.2.3 TfUbcE2-D2基因序列分析

通過Expasy (http://www.au.expasy.org/) 對TfUbcE2-D2的cDNA序列進行蛋白翻譯、分子量及等電點預(yù)測，通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測，在NCBI上BLAST搜查同源序列對其在氨基酸水平上進行同源比對，用ClustalW和BioEdit進行同源序列比對分析。

2.2.4 實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，real-time PCR)

根據(jù)克隆所得的TfUbcE2-D2 cDNA序列設(shè)計real-time PCR的引物qRTF、qRTR(見表1)，以對照組和刺激組的各時間點的cDNA為模板，進行real-time PCR。以β-Actin為內(nèi)參基因，所用引物分別為ActinF和ActinR(見表1)。具體反應(yīng)體系和步驟參見SYBR○RPremix Ex TaqTM說明書。每個待測樣品cDNA設(shè)置3個平行，mRNA相對表達量根據(jù)2-ΔΔCt法計算，使用T檢驗的方法分析差異顯著性，P<0.05為可接受的顯著性差異標準[6]。

表1 本研究所用的PCR引物序列Tab.1 The sequences of PCR primers

3 實驗結(jié)果

3.1 TfUbcE2-D2基因克隆和序列分析

通過對測序結(jié)果進行拼接，得到TfUbcE2-D2的cDNA序列全長993 bp，包括5′非編碼區(qū)308 bp、3′非編碼區(qū)220 bp，開放閱讀框444 bp，編碼147個氨基酸(見圖1)。3′端有加尾信號(AATAAA)，加尾信號后16 bp處有polyA尾巴。經(jīng)ExPASy在線預(yù)測，TfUbcE2-D2蛋白質(zhì)分子量(MW)為16.5 kD，理論等電點(PI)為6.80。通過SignalP 4.1預(yù)測N端沒有信號肽。SMART預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白在第4～147位有一個結(jié)構(gòu)域Ubcc，主要為泛素結(jié)合酶催化區(qū)域。

3.2 同源比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將TfUbcE2-D2蛋白分別與人(NP_862821.1Homosapiens)，白尾海雕(XP_009912166.1Haliaeetusalbicilla)，綠海龜(XP_007054447.1Cheloniamydas)，爪蟾(NP_001084434.1Xenopuslaevis)，大西洋鮭(ACN12778.1Salmosalar)，白斑狗魚(ACO13579.1Esoxlucius)，胡瓜魚(ACO09151.1Osmerusmordax)，斑點叉尾鮰(NP_001187535.1Ictaluruspunctatus)和斑馬魚(NP_957253.1Daniorerio)的UbcE2-D2 蛋白進行氨基酸比對，其相似度介于 74.15%～91.84%。10個物種氨基酸序列的同源性為92.31%(見圖2)。

通過MEGA4.0的NJ法(Neighbor-joining)，構(gòu)建了羅非魚(XP_003447669.1Oreochromisniloticus)、大黃魚(XP_010752718.1Larimichthyscrocea)、紅鰭東方鲀(XP_003978539.1Takifugurubripes)、綠海龜(XP_007054447.1Cheloniamydas)、白尾海雕(XP_009912166.1Haliaeetusalbicilla)、家鼠(NP_064296.1Musmusculus)和TfUbcE2-D2的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，松江鱸TfUbcE2-D2與同為鱸形總目的羅非魚和大黃魚的UbcE2-D2關(guān)系最近，所有魚類的UbcE2-D2單獨聚為進化樹的一大分支，其他脊椎動物的UbcE2-D2 聚為一支(見圖3)。

3.3 TfUbcE2-D2的表達分析

3.3.1 TfUbcE2-D2的組織分布

real-time PCR結(jié)果表明，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸各組織，且表達存在組織特異性，其中在腎臟的表達量最高，其次是鰓，表達量最低的是胃(見圖4)。

3.3.2 鰻弧菌刺激后TfUbcE2-D2的表達模式分析

受鰻弧菌刺激后，TfUbcE2-D2于松江鱸的脾臟、肝臟和鰓中表達量急劇上升，分別在6 h、12 h、6 h時上調(diào)至最高點。在血液中，刺激后2 h TfUbcE2-D2表達量稍有上調(diào)，為對照組的1.4倍。但是在腎臟中，受刺激后表達下調(diào)，直至實驗結(jié)束表達量仍低于正常水平(見圖5)。

4 討論

泛素-蛋白酶體途徑廣泛參與細胞凋亡、周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生命活動過程[5]。其中UbcE2負責在泛素和底物蛋白之間催化形成異肽鍵，擁有一個大約由150個氨基酸組成的Ubcc結(jié)構(gòu)域。在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，具有一個特殊的半胱氨酸殘基，該殘基在泛素和E2酶之間形成硫酯鍵起關(guān)鍵作用[7]。本實驗結(jié)果表明TfUbcE2-D2具有一個Ubcc結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含保守的半胱氨酸殘基。將TfUbcE2-D2和多個已知的其他物種泛素結(jié)合酶E2-D2進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)蛋白保守度高，尤其第85位半胱氨酸殘基各物種保持一致，且其前后的氨基酸也高度保守，多為I(/V)CL。

作為參與機體基礎(chǔ)代謝的酶類，大部分研究表明UbcE2在維持機體自身穩(wěn)態(tài)和生殖方面發(fā)揮著重要的作用[8—10]，而陳安靜研究發(fā)現(xiàn)，對蝦(Penaeusorientalis)的泛素結(jié)合酶E2(FcUbc)通過介導(dǎo)泛素化而抑制了白斑綜合癥病毒(WSSV)的復(fù)制[4]。本研究結(jié)果顯示，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸10個組織，而在腎臟中表達量最高，鰓次之。TfUbcE2-D2表達的普遍性說明其可能在松江鱸基礎(chǔ)代謝方面發(fā)揮著重要的生理功能。腎臟是魚類的一個重要的免疫器官，其吞噬細胞可吞噬自身衰老細胞及病原微生物等。大菱鲆(Scophthalmusmaximus)中的趨化因子受體CCR3和CCR9[11]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)中的C-型溶菌酶[12]、紅笛鯛(Lutjanussanguineus)中的非特異性細胞毒性細胞膜受體(NCCRP-1)[13]等在腎臟中的表達量很高，另外，松江鱸的免疫相關(guān)基因硫氧還蛋白1(Trx1)[14]、髓樣分化因子MyD88[15]、CD302(未發(fā)表)等在腎中的表達量也很高。鰓是魚體內(nèi)的黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)，內(nèi)含淋巴細胞、巨噬細胞和各類粒細胞[16]，為防止生物體感染提供了關(guān)鍵的免疫監(jiān)視[17]。TfUbcE2-D2在松江鱸腎臟和鰓中高表達量表明 TfUbcE2-D2可能參與免疫。

圖1 TfUbcE2-D2的cDNA序列全長及演繹的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of TfUbcE2-D2起始密碼子和終止密碼子用粗體標注，“*”代表終止密碼子，陰影部分是UBCc結(jié)構(gòu)域，加尾信號用下劃線標出，保守半胱氨酸殘基用方框標出The start and stop condons in bold，the asterisk (*) represented the stop codon，the structure domain was shown in shadow，the predicted polyadenylation signal AATAAA was underlined and conservative cysteine was shown in box

圖2 松江鱸TfUbcE2-D2和其他物種的UbcE2-D2的氨基酸多序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of TfUbcE2-D2 with the other UbcE2-D2 proteins using Clustal W method TfUbcE2-D2的催化位點用矩形框標出Catalytic sites of TfUbcE2-D2 was indicated with rectangular box

圖3 基于TfUbcE2-D2的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TfUbcE2-D2 with the other UbcE2-D2 proteins

圖4 TfUbcE2-D2在正常組織中的表達模式(n=3)Fig.4 Constitutive expression of TfUbcE2-D2 in different tissues of normal Roughskin soulpin(n=3)

圖5 TfUbcE2-D2受鰻弧菌刺激后不同組織表達模式變化Fig.5 Temporal expressions of TfUbcE2-D2 analyzed by real-time PCR after Vibrio anguillarum challenge柱狀圖顯示了實時定量PCR的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，星號指示刺激組與對照組(0 h)之間的T檢驗結(jié)果，“*”表明有顯著性差異，“**”表示有極顯著差異；誤差線是通過對3次獨立實驗進行統(tǒng)計分析所得到的標準差；(* P<0.05; **P<0.01)The results of real-time PCR was expressed as histogram，the asterisk represented the differences from the control samples(*， P<0.05; **，P<0.01) .The error bars represent ±SD of three independent PCR amplifications and quantifications

受鰻弧菌刺激后，松江鱸脾臟、肝臟和鰓中的TfUbcE2-D2 表達量明顯上調(diào)，其中在脾臟和鰓中達到了40倍左右。脾臟是真骨魚中唯一的淋巴結(jié)樣器官，其黑素-巨噬細胞中心具有吞噬細胞功能，同時在體液免疫中也發(fā)揮著一定的作用[16]。魚類肝臟通過對病原體的吞噬、細菌的凝集等在宿主防御微生物入侵過程中起到非常重要的作用[18—19]。 鯉魚的Akirin2[20]經(jīng)鰻弧菌刺激后，在脾和肝臟中表達量均明顯上調(diào)；松江鱸免疫相關(guān)基因C-型凝集素[21]、MyD88、 半乳糖凝集素[21]、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶4(IRAK-4)[22]，受刺激后在脾和肝臟中均迅速上調(diào)表達 。鰻弧菌刺激后TfUbcE2-D2基因在松江鱸脾和肝臟中表達上調(diào)可能與TfUbcE2-D2迅速參與外來蛋白降解有關(guān)系。受刺激后TfUbcE2-D2在鰓中大幅上調(diào)可能與其抵抗外來病原體也有一定的關(guān)系。刺激后腎臟中TfUbcE2-D2的下調(diào)，可能是因為mRNA迅速合成蛋白用于對外來病原體蛋白的降解。但其確切下調(diào)機理有待進一步研究。

綜上所述，TfUbcE2-D2作為UPP途徑中的一個重要酶，推測其參與了松江鱸的先天免疫，并在其先天免疫中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果為研究泛素結(jié)合酶在魚類先天性免疫作用奠定了一定的基礎(chǔ)，也為

松江鱸的保護提供了參考，但關(guān)于其在免疫應(yīng)答中的具體作用機制仍待進一步深入探討。

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Molecular cloning and expression analysis of ubiquitin-conjugating enzyme E2-D2 in roughskin sculpin，Trachidermus Fasciatus

Chen Xuezhao1，Zhang Lei1，Yu Shanshan1，Bi Caihong1，Liu Chunying1，Zhu Qian1

(1.SchoolofMarineScience，ShandongUniversity(Weihai)，Weihai264209，China)

Ubiquitin-conjugating enzyme is the second enzyme in the process of protein ubiquitination and plays an important role in ubiquitin transferring and substrate specific recognition. In this study，we cloned the full-length cDNA from the Roughskin sculpin，Trachidermusfasciatusby RACE，and named as TfUbcE2-D2. The cDNA of TfUbcE2-D2 is 993 bp，which contained an open reading frame (ORF) of 444 bp encoding a polypeptide of 147 amino acids. The deduced amino acid sequence had a domain called Ubcc，which was extremely conservative. The mRNA expression of TfUbcE2-D2 in healthy andVibrioanguillarumchallenge was detected by quantitative real-time PCR，results showed that TfUbcE2-D2 was expressed in all the detected tissues，mainly expressed in kidney and gill. The up-regulated of TfUbcE2-D2 post challenge withVibrioanguillarumin blood，spleen，liver and gill indicated that it might be involved in the innate response of Roughskin sculpin．

ubiquitin-conjugating enzyme;Trachidermusfasciatus;gene clone;innate immunity

2015-03-25；

2015-07-28。

威海市科技攻關(guān)計劃項目(0000413420608)； 威海市科委項目(1070432121313)。

陳學(xué)昭(1990—), 女，山東省臨沂市人，主要研究方向為松江鱸免疫基因。E-mail：chenxuezhao900601@163.com

*通信作者：祝茜, 博士生導(dǎo)師, 教授。E-mail:qianzhu@sdu.edu.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.013

Q95

A

0253-4193(2015)10-0133-08

陳學(xué)昭，張雷，于珊珊，等. 松江鱸(Trachidermusfasciatus)泛素結(jié)合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析[J].海洋學(xué)報，2015，37(10)：133—140，

Chen Xuezhao，Zhang Lei，Yu Shanshan，et al. Molecular cloning and expression analysis of ubiquitin-conjugating enzyme E2-D2 in roughskin sculpin，TrachidermusFasciatus[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(10)：133—140，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.013