布魯氏菌感染誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的初步研究

劉娟，孫志華，張靜，張?jiān)?，劉?lái)珍，李明奇，張輝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

布魯氏菌感染宿主細(xì)胞需經(jīng)過(guò)黏附、侵入、運(yùn)輸、復(fù)制和傳播等復(fù)雜的步驟[1-4]。布魯氏菌的抗感染免疫過(guò)程主要包括先天性免疫和獲得性免疫。天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵御病原生物入侵的第一道防線(xiàn)，也是獲得性免疫的基礎(chǔ)[5]。因此，天然免疫系統(tǒng)既可以通過(guò)誘導(dǎo)吞噬作用和炎癥反應(yīng)等途徑對(duì)入侵的病原快速識(shí)別和清除，還在誘導(dǎo)和激活獲得性免疫反應(yīng)中至關(guān)重要。布魯氏菌通過(guò)LPS等PAMPs被宿主細(xì)胞表達(dá)的PRRs識(shí)別進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，引起炎癥反應(yīng)[6-7]。NLRP3激活后形成的NLRP3炎癥小體是是迄今為止結(jié)構(gòu)和功能最為明確的炎癥小體，也是研究最多的一種炎癥小體，主要由NLRP3、ASC和caspase-1組成[8]。NRP3炎癥小體能被細(xì)菌（李斯特桿菌、結(jié)核分枝桿菌等）、病毒（腺病毒、流感病毒）激活[6-11]，但是目前布魯氏菌感染與NRP3炎癥小體關(guān)系還不明確。

本研究通過(guò)比較布魯氏菌侵染宿主前后NLRP3炎癥小體相關(guān)分子和炎癥因子IL-18和IL-1β的表達(dá)情況，初步探討布魯氏菌感染與炎癥小體的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步研究布魯氏菌的胞內(nèi)存活機(jī)制和致炎機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞

牛種布魯氏菌參考株2308（Brucella abortus 2308）由本實(shí)驗(yàn)室保存；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；NLRP3、Caspase-1、β-actin引物由華大基因合成；TRIzol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；NLRP3抗體購(gòu)自 abcam公司；Caspase-1抗體和山羊抗兔 IgG均購(gòu)自Bioworld公司；NC膜購(gòu)自 Solarbio公司；DAB顯色液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-1β/IL-18 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 牛種布魯氏菌參考株2308和細(xì)胞的培養(yǎng)

將甘油凍存的牛種布魯氏菌參考株2308菌液在布魯氏菌無(wú)抗平板上進(jìn)行四分區(qū)劃線(xiàn)，37℃ 恒溫培養(yǎng)3-5 d，挑選單個(gè)菌落接種于新鮮的20 mL Brucella Broth培養(yǎng)基中，37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)至OD600=0.4，再取20μL菌液轉(zhuǎn)接于20 mL Brucella Broth培養(yǎng)基，37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0～1.5，備用。

將液氮中凍存的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7取出后迅速投入到37℃水浴中使其快速融化，吸取細(xì)胞懸液于新的預(yù)先加入3-5 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液的15 mL離心管中，充分吹打混勻，800 r/min離心5 min，棄去上清培養(yǎng)液，用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，37℃，5%的CO2濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每24 h更換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)3-5 d。

1.2.2 布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7模型建立

將培養(yǎng)的細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌緩沖液清洗細(xì)胞3次，每孔加入2 mL新鮮的含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。純化培養(yǎng)的牛種布魯氏菌參考株2308以100∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）的比例進(jìn)行侵染模型的建立，陰性對(duì)照加入等體積的PBS，侵染1 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖洗滌液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)加入慶大霉素（2.5μL/孔/mL）繼續(xù)培養(yǎng)45 min，以殺死胞外菌，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖洗滌液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在4、12、24和48 h取上清和細(xì)胞沉淀備用。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的表達(dá)水平

分別在侵染4、12、24和48 h時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)，預(yù)冷的PBS洗滌緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，每孔加入1 mL TRIZOL，用移液器反復(fù)吹打細(xì)胞，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，冰上放置10 min，按TRIZOL法提取侵染細(xì)胞總RNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄20 uL體積的cDNA產(chǎn)物。利用 Premier 6.0設(shè)計(jì)引物（表1），通過(guò)RT-PCR檢測(cè) NLRP3炎癥小體信號(hào)通路相關(guān)分子的 mRNA表達(dá)，以?xún)?nèi)參β-action做對(duì)照。

表1 基因引物序列Tab.1 Primers sequences of gene

1.2.4 Western blot檢測(cè) RAW 264.7細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的表達(dá)水平

分別在侵染4、12、24和48 h時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)，預(yù)冷的PBS洗滌緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，每孔加入200μL含1%PMSF的非變性組織裂解液，冰上放置10 min，細(xì)胞刮刀收集裂解后樣品于心的1.5 mL離心管中，4℃，13000 r/min離心 15 min，上清即為蛋白樣品。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度，并調(diào)整各個(gè)時(shí)間段的樣品濃度至同一水平，然后進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳檢測(cè)。恒流200 mA，1 h后采用半干濕轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，37℃封閉1 h。TBST洗3次，每次10 min，然后加入一抗稀釋液中，4℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min。再加二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，DAB顯色，掃描保存圖像。

1.2.5 ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β和IL-18的釋放量

分別收集布魯氏菌侵染RAW 264.7細(xì)胞4、12、24和48 h后的細(xì)胞上清，0.22μm的濾膜過(guò)濾后3000 g離心10 min，若在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行ELISA檢測(cè)，-4℃冰箱中保存即可；否則應(yīng)在-20或-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。通過(guò)RD公司的小鼠IL-1β/IL-18 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW 264.7巨噬細(xì)胞總RNA的提取結(jié)果

提取布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞后總RNA，1%的變性瓊脂糖電泳檢測(cè)可以清楚的看到28S、18S和5.8S三條帶（圖1），說(shuō)明RNA質(zhì)量很好。

圖1 布魯氏菌侵染后總RNA提取Fig.1 Total RNA of Brucella post-infection

2.2 NLRP3和 Caspase-1 mRNA的表達(dá)檢測(cè)

RT-RCR的結(jié)果（圖2）顯示，在不同的時(shí)間點(diǎn)，侵染組細(xì)胞的 NLRP3和Caspase-1 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組均存在差異（P＜0.05），其中侵染組細(xì)胞NLRP3在4、12和24 h mRNA的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，但48 h出現(xiàn)下降；而Caspase-1在4、12和24 h表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，在48 h時(shí)出現(xiàn)下降，且Caspase-1 mRNA表達(dá)在12 h時(shí)達(dá)到最高水平。

圖2 布魯氏菌侵染后NLRP3和Caspase-1mRNA表達(dá)量Fig.2 The mRNA expression of NLRP3 and Caspase-1 after Brucella infection

2.3 Western blot檢測(cè)

采用半干濕轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3和 Caspase-1表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠 RAW 264.7巨噬細(xì)胞NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression of NLRP3 and Caspase-1

圖3顯示，布魯氏菌侵染 4、12、24和 48 h后小鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比出現(xiàn)不同程度的升高。

2.4 炎癥因子IL-1β和IL-18 ELISA檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)細(xì)菌在不同的時(shí)間點(diǎn)侵染細(xì)胞后上清中IL-1β和IL-18含量，結(jié)果（圖4）顯示，牛種布魯氏菌2308株侵染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子IL-1β在4、12、24和48 h時(shí)含量均顯著高于對(duì)照組，且在12 h時(shí)達(dá)到最高水平。

與對(duì)照組相比，牛種布魯氏菌侵染組細(xì)胞因子IL-18的含量在不同的時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，且在24 h時(shí)達(dá)到最高水平（圖5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β的變化Fig.4 Level of pro-inflammatory cytokines IL-1βin RAW 264.7 cells

圖5 小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子IL-18的變化Fig.5 Level of pro-inflammatory cytokines IL-18 in RAW 264.7 cells

3 討論

天然免疫應(yīng)答在抵御病原微生物早期感染及順利啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞均能快速識(shí)別病原菌的入侵，進(jìn)而釋放大量的促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，固有免疫在布魯氏菌的感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究布魯氏菌感染與細(xì)胞炎癥小體間的關(guān)系，可為進(jìn)一步的研究布魯氏菌的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

（1）固有免疫系統(tǒng)模式識(shí)別受體共有四類(lèi)，即TLR、NLR（NOD樣受體），CLR(凝集素樣受體)和RLR(解旋酶樣受體)，其中TLR和 NLR是識(shí)別病原微生物并誘導(dǎo)炎癥的受體[12]。NLRP3炎癥小體是識(shí)別配體并誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，NLRP3主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和一些初級(jí)免疫細(xì)胞中，主要分布在細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞膜中[13]。存在于胞內(nèi)的部分NLR激活后形成巨大的蛋白復(fù)合體“炎癥小體”，激活 caspase-1，進(jìn)而對(duì) IL-1β 和 IL-18等炎癥因子的前體形式進(jìn)行切割，使其成熟并釋放至胞外，引起炎癥反應(yīng)[14]。NLRP3炎性小體是迄今為止結(jié)構(gòu)和功能最為明確的炎性小體，主要由 NLRP3、ASC和 caspase-1共同組成[15-16]。本研究證實(shí)布魯氏菌感染同其他胞內(nèi)寄生菌一樣都可以激活NLRP3炎癥小體，與多種病原微生物，特別是兼性胞內(nèi)寄生菌的分子機(jī)制相同[6-7，17]。

（2）炎癥小體活化所介導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生及細(xì)胞死亡與機(jī)體抵御病原微生物感染、維持自身穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。病原微生物感染宿主后，炎癥小體被活化，產(chǎn)生IL-1β和IL-18等促炎因子介導(dǎo)炎癥發(fā)生，但是炎癥反應(yīng)在清除微生物感染的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致組織損傷，所以機(jī)體需及時(shí)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制促炎因子過(guò)度產(chǎn)生，維持機(jī)體的正常生理功能。IL-1β和IL-18是重要的炎性細(xì)胞因子，與天然免疫防御的起始、加強(qiáng)等至關(guān)重要。IL-1β在炎癥引起的發(fā)熱方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，是機(jī)體對(duì)抗病原微生物入侵、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和組織損傷的重要物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)外均可誘導(dǎo)二級(jí)細(xì)胞因子（如IL-6、趨化因子）的產(chǎn)生[18]。IL-18是研究發(fā)現(xiàn)的第一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，還具有誘導(dǎo)其他促炎性細(xì)胞因子和增強(qiáng)NK細(xì)胞黏附分子活性等功能[19-20]。因此，本研究中通過(guò)檢測(cè)IL-1β和IL-18等促炎因子的表達(dá)量來(lái)確定布魯氏菌感染與炎癥小體的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞后NLRP3和caspase-1的 mRNA和蛋白均顯著增加，同時(shí) IL-1β和 IL-18的含量也顯著升高，布魯氏菌感染可激活NLRP3炎癥小體。這將為布魯氏菌感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)和致病分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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