甘草查爾酮A抑制小鼠黑色素瘤B16F10細胞糖酵解表型和誘導(dǎo)凋亡

王艷明，劉瑛，閻新燕，司玲玲，高彩霞，于麗娜，鄭秋生，3

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子 832000；2濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，煙臺 264003；3煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺264005）

惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率逐年增加，它是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。惡性腫瘤具有快速增殖、抵抗凋亡、無限復(fù)制潛能、促進血管生成、組織侵襲轉(zhuǎn)移等特征[1]，在能量代謝方面，腫瘤細胞主要依賴無氧酵解（糖酵解）代謝，主要表現(xiàn)為葡萄糖攝取量增加、乳酸堆積，這些現(xiàn)象已經(jīng)被認為是腫瘤細胞典型糖酵解特征[2]。富氧條件下，正常細胞通過有氧酵解的線粒體氧化磷酸化途徑產(chǎn)生ATP，滿足正常細胞代謝生長的需求；腫瘤細胞則依賴糖酵解以高速率的方式產(chǎn)生更多ATP，滿足腫瘤細胞快速生長、增殖和代謝的需求。研究表明：糖酵解不僅能夠為腫瘤細胞提供足夠的能量和生長所必須的大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等）[3]，還能為腫瘤細胞進一步擴大和轉(zhuǎn)移提供有利環(huán)境[4]。目前，腫瘤能量代謝已經(jīng)成為熱點研究之一。糖酵解是惡性腫瘤細胞生長、增殖、代謝的能量保障，通過抑制惡性腫瘤細胞特異的糖酵解代謝，是治療惡性腫瘤的策略之一。

甘草查爾酮A是一種酚類查爾酮化合物，大量分布于甘草根莖中，具有抗寄生物[5]、抗菌[6]、抗腫瘤[7]等作用。現(xiàn)階段甘草查爾酮A對腫瘤細胞能量代謝方面的研究較少，因此，本研究通過探討甘草查爾酮A抑制B16F10細胞糖酵解表型和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，為今后靶向抑制黑色素瘤能量代謝研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

小鼠黑色素瘤細胞 B16F10購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，本實驗室液氮冷凍保存。

1.1.2 藥品及試劑

甘草查爾酮A（成都普瑞法生物科技有限公司，純度為 98%，批號：14022606）；DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，批號：1342967）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：140130）；磺基羅丹明B（Sulforhodamine B，SRB，Sigma，批號：3520421）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，批號：51596BPV）Giemsa干粉（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：R246403）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號：20141105147）；乳酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20141226）；ATP含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20141222）；AnnexinV/FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20150104）。

1.1.3 儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司，Thermo 3131）；多功能酶標儀（美國 Thermo公司，Thermo 3001）；倒置熒光顯微鏡（德國 ZEISS公，MIC00266，）；流式細胞儀（美國BD公司，F(xiàn)ACSCalibur）；MH-2微量振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

取生長狀態(tài)良好細胞B16F10，用含10%胎牛血清、鏈霉素（100μg/mL）、慶大霉素（100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液（pH=7.5），在37℃、5%CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行各項實驗。

1.2.2 甘草查爾酮A母液配制

稱取甘草查爾酮A 17 mg放入0.5 mL離心管中，加入DMSO 500μL將其溶解，即為100μmol/L甘草查爾酮A母液。臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2.3 SRB法測定細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期B16F10細胞，計數(shù)后用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，以細胞數(shù)0.8×104/mL接種于96孔板中（100μL/孔），培養(yǎng)過夜，然后加不同濃度的甘草查爾酮A完全培養(yǎng)基100μL，使終濃度分別為 0、15、30、45、60、75、90μmol/L，繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h和48 h，一定時間后，每孔加入50%（質(zhì)量/體積）的三氯乙酸（TCA）50μL固定細胞，然后在4℃冰箱中放置1 h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，完全去除多余TCA，室溫晾干96孔板，每孔加0.4% 的SRB 100μL，在室溫下放置20 min，棄去各孔內(nèi)液體后，用1% 乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干，用DMSO（二甲基亞砜）150 μL溶解，微量振蕩器上振蕩8 min使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀在515 nm波長下檢測每孔吸光度（OD）值。并按公式計算藥物對細胞增殖的抑制率：

1.2.4 細胞培養(yǎng)液中葡糖糖含量檢測

取對數(shù)期細胞，消化，接種于6孔板，待細胞貼壁狀態(tài)良好時，加甘草查爾酮A，使孔內(nèi)濃度分別為 0、30、45和 60μmol/L，將其放入 37℃，5%CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出6孔板，吸出培養(yǎng)液于離心管，3000 r/min離心5 min，留取上清培養(yǎng)液備用。按照普利萊基因技術(shù)試劑盒說明書操作后，在多功能酶標儀550 nm處測定吸光度值。

1.2.5 細胞培養(yǎng)液中乳酸含量測定

取對數(shù)期細胞，消化，接種于6孔板，待細胞貼壁狀態(tài)良好時，加甘草查爾酮A，使孔內(nèi)濃度分別為0、30、45和 60μmol/L，將其放入 37℃，5%CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出6孔板，吸出上清培養(yǎng)液于離心管，3000 r/min離心5 min，留取上清培養(yǎng)液備用。然后按照南京建成生物工程研究所說明書操作后，在多功能酶標儀530 nm處測定吸光度值。

1.2.6 細胞內(nèi)ATP含量測定

取對數(shù)期細胞，消化，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁狀態(tài)良好時，加甘草查爾酮A，使終濃度分別為 0、30、45、60μmol/L，將其放入 37℃，5%CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，消化，離心，收集細胞，將收集好細胞加入300μL熱雙蒸水，放在熱水浴（90-100℃）中勻漿破碎后，在沸水浴中加熱10 min，取出混勻抽提1 min后，按照南京建成生物工程研究所說明書操作后，在多功能酶標儀636 nm處測定吸光度值。

1.2.7 Giemsa染色觀察細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期細胞，消化，離心后，以1.5×105鋪6孔板（2 mL/孔），待細胞貼壁狀態(tài)良好后，用終濃度為0，30，45和60μmol/L甘草查爾酮A處理B16F10細胞24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，每孔加固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）1 mL，固定30 min后，吸棄固定液，PBS洗2遍，每孔加Giemsa染色液1.5 mL，染色 15 min，吸棄染液，PBS洗 2-3遍，吸棄PBS，晾干，鏡下觀察并拍照。

1.2.8 Hoechst33258染色觀察細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期細胞，消化，離心后，以1.5×105鋪6孔板（2 mL/孔），待細胞貼壁狀態(tài)良好，用終濃度為0、30、45、60μmol/L甘草查爾酮A處 理B16F10細胞24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用固定液（甲醇∶冰醋酸 =3∶1）固定10 min，用 PBS洗2遍，晾干，加適量Hoechst33258染色液染色10 min，PBS洗去未結(jié)合的熒光染料洗凈，鏡下觀察并拍照。

1.2.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

細胞經(jīng)藥物作用24 h后，3000 r/min離心5 min，收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞1次，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/mL，加入Binding buffer懸浮細胞液500μL，加入Annexin V-FITC 5μL，混勻后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5μL，再次混勻。室溫，避光，反應(yīng) 10 min，在 1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。激發(fā)波長 Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm。

1.3.0 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均設(shè)3個平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以±S表示，以t檢驗（Origin7.5統(tǒng)計軟件）進行組間比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草查爾酮A明顯抑制B16F10細胞生長

甘草查爾酮A以不同濃度分別作用于B16F10細胞24或48 h，隨藥物濃度升高，細胞抑制率明顯增高，呈濃度依賴性和時間依賴性（圖1）。24和48 h的 IC50分別為（47.31±2.06）μmol/L和（36.88±1.2）μmol/L。

圖1 甘草查爾酮A對B16F10細胞增殖影響Fig.1 Effect of Licochalcone A on the proliferation of B16F10 cells

2.2 甘草查爾酮A抑制B16F10細胞攝取葡萄糖

腫瘤細胞通過大量攝取葡萄糖獲取足夠的能量和生物大分子物質(zhì)，以滿足自身快速增殖的需求。甘草查爾酮A能濃度依賴性的抑制B16F10細胞攝取葡萄糖（圖2）。

圖2 甘草查爾酮A對B16F10細胞葡萄糖攝取量的影響Fig.2 Effect of Licochalcone A on the glucose uptake of B16F10 cells

2.3 甘草查爾酮A抑制B16F10細胞乳酸生成

葡萄糖被攝入腫瘤細胞后，經(jīng)過多種糖酵解激酶的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物乳酸，乳酸的大量堆積有利于腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。不同濃度甘草查爾酮 A（0、30、45、60μmol/L）作用于 B16F10細胞24 h后，明顯減少B16F10細胞培養(yǎng)液中乳酸含量，并呈濃度依賴性（圖3）。

圖3 甘草查爾酮A對B16F10細胞培養(yǎng)液中乳酸生成的影響Fig.3 Effect of Licochalcone A on the extracellular lactic acid production of B16F10 cells

2.4 甘草查爾酮A抑制B16F10細胞內(nèi)ATP的生成

正常細胞通過有氧酵解的線粒體氧化磷酸化途徑產(chǎn)生ATP，而腫瘤細胞依賴糖酵解高速率產(chǎn)生ATP，維持細胞活躍的能量代謝。從圖4可知，甘草查爾酮A能濃度依賴性抑制B16F10細胞內(nèi)ATP的生成。

圖4 甘草查爾酮A對B16F10細胞內(nèi)ATP生成的影響Fig.4 Effect of Licochalcone A on the intracellular ATP production of B16F10 cells

2.5 甘草查爾酮A對B16F10細胞形態(tài)影響

甘草查爾酮A作用B16F10細胞24 h后，Giemsa染色觀察細胞形態(tài)，對照組細胞貼壁狀態(tài)良好，呈不規(guī)則梭形，隨著藥物濃度的增加（30、45、60μmol/L），細胞數(shù)量逐漸減少，高濃度組細胞（60μmol/L）呈固縮圓形結(jié)構(gòu)（圖5）。Hoechst 33258染色進一步觀察細胞形態(tài)，如圖6所示，正常組細胞染色均勻，細胞大而飽滿，隨著藥物濃度的增加（30、45、60μmol/L），細胞出現(xiàn)典型凋亡特征：細胞體積逐漸變小，胞核皺縮，碎裂，呈現(xiàn)致密顆粒狀熒光。

圖5 Giem sa染色法觀察甘草查爾酮A對B16F10細胞形態(tài)影響（×200）Fig.5 Effect of Licochalcone A on morphological changes in B16F10 cells observed by Giemsa staining(×200)

圖6 Hoechst 33258染色法觀察甘草查爾酮A對B16F10細胞凋亡形態(tài)影響（×400）Fig.6 Effect of Licochalcone A on apoptotic morphological changes in B16F10 cells observed by Hoechst 33258 staining(×400)

2.6 甘草查爾酮A誘導(dǎo)B16F10細胞凋亡

為進一步明確甘草查爾酮A對B16F10細胞凋亡的影響，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。圖7細胞流式散點圖中，A表示右上象限（細胞晚期凋亡），B表示右下象限（細胞早期凋亡）。甘草查爾酮A能誘導(dǎo)B16F10細胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡（圖7、圖 8）。

與對照組相比，高濃度組（45和60μmol/L）早期凋亡（P<0.01）具有顯著性差異；且高濃度組（45和60μmol/L）晚期凋亡也（P<0.05，P<0.01）具有差異性，其中高濃度組（60μmol/L）細胞晚期凋亡率達38.1%±1.90%（圖 8）。

圖7 細胞流式散點圖Fig.7 Flow cytometry scatter diagram

圖8 甘草查爾酮A對B16F10細胞凋亡率影響Fig.8 Effect of Licochalcone A on apoptotic rates of B16F10 cells

3 討論

惡性黑色素瘤是由皮膚和其他器官黑素細胞產(chǎn)生的腫瘤，其發(fā)病率與總體死亡率依舊呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[8]，給人類健康帶來巨大威脅。深入認識黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制對于開辟新的治療黑色素瘤方法有重要意義。近年來，探索通過靶向糖酵解代謝途徑治療惡性腫瘤的策略正備受關(guān)注[9]。

糖酵解被認為是腫瘤細胞特征性表型之一[10]。腫瘤細胞依賴糖酵解獲得足夠的能量和必須生物大分子物質(zhì)，以滿足細胞快速增殖，無限復(fù)制的需求。葡萄糖攝取量快速增加和乳酸大量堆積是腫瘤細胞典型糖酵解特征。腫瘤細胞能通過細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)錄蛋白攝入葡萄糖，隨后大部分的葡萄糖經(jīng)過多種糖酵解激酶的催化，生成ATP和大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)的生成有利于腫瘤細胞快速生長、增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤。另外，乳酸的大量積累會使腫瘤細胞微環(huán)境酸化，這種酸性環(huán)境有利于腫瘤細胞的生存[4]。本實驗室前期高通量測序結(jié)果顯示：糖酵解與黑色素瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且黃酮類化合物異甘草素能顯著抑制黑色素瘤B16F0細胞糖代謝，本實驗中甘草查爾酮A是與異甘草素分子結(jié)構(gòu)極為相似的黃酮類化合物；B16F10細胞和B16F0細胞都是小鼠黑色素瘤細胞，兩者相比，B16F10細胞惡性程度、轉(zhuǎn)移和浸潤能力更高，因此推測甘草查爾酮A可能對B16F10細胞糖代謝有抑制作用。結(jié)果顯示，甘草查爾酮A能顯著抑制B16F10細胞增殖和細胞糖酵解表型（細胞葡萄糖攝取量、細胞外乳酸含量和細胞內(nèi)ATP含量明顯減少）。

腫瘤細胞糖酵解代謝與凋亡有密切聯(lián)系。研究表明：腫瘤細胞糖酵解代謝受到抑制時，還伴隨細胞凋亡的發(fā)生[11-13]。為明確甘草查爾酮A抑制B16F10細胞糖酵解過程中是否伴隨細胞凋亡發(fā)生，首先通過Giemsa和Hoechst 33258染色法觀察細胞形態(tài)，其中Gimesa染色結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，細胞數(shù)量逐漸減少，高濃度組細胞（60μmol/L）呈固縮圓形狀；Hoechst 33258染色結(jié)果顯示：加藥組細胞出現(xiàn)典型凋亡特征：細胞核體積逐漸縮小，胞核皺縮，碎裂，呈現(xiàn)致密顆粒狀熒光狀；隨后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，甘草查爾酮A能濃度依賴性的誘導(dǎo)B16F10細胞凋亡，與對照組相比，高濃度組細胞（45和60μmol/L）的早期凋亡率具有顯著性差異（P<0.01）。

綜上所述，甘草查爾酮A可能是通過抑制B16F10細胞攝取葡萄糖，減少乳酸和ATP生成，使細胞無法獲得足夠的能量和細胞增殖必須的生物大分子物質(zhì)，削弱B16F10細胞糖酵解代謝，從而抑制B16F10細胞增殖。由于腫瘤細胞長期處于“饑餓”狀態(tài)，就會引起應(yīng)激性反應(yīng)—凋亡的發(fā)生，腫瘤細胞可以通過誘導(dǎo)部分細胞凋亡，減少能量消耗，增加自身生存的幾率。這些結(jié)果表明，甘草查爾酮A能通過抑制B16F10細胞糖酵解表型和誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)抗黑色素瘤作用。

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