朊蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

田甜，徐江，邱雪冰

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，石河子 832000）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (head and neck squamous cell carcinomas，HNSCC)泛指發(fā)生于口腔頜面部，咽喉及上呼吸消化道等部位的鱗狀細(xì)胞癌。它是頭頸部惡性腫瘤的主要病理類型，約占頭頸部惡性腫瘤的95%[1-2]。HNSCC居于所有癌癥病死率的第六位，全世界每年新發(fā)病例50萬[3]，HNSCC的發(fā)病率有明顯增長趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。HNSCC具有影響患者進(jìn)食、致頜面部組織缺損、高發(fā)病率、低生存率等特點[4]。朊蛋白（prion protein，PrP）與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性等密切相關(guān)[5]，此外還有研究發(fā)現(xiàn)PrP可能以通過上調(diào)抗凋亡蛋白（Bcl-2）表達(dá)并抑制凋亡前體蛋白(Bax)基因、p53和細(xì)胞色素C，發(fā)揮抗凋亡的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)PrP的高表達(dá)在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中角色十分重要[7-10]。本課題探討了PrP在HNSCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用，以期尋找HNSCC早期診斷、預(yù)后判斷的分子指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般材料

收集1993-2013年新疆維吾爾自治區(qū)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科及耳鼻咽喉科經(jīng)手術(shù)切除、病理診斷明確且病歷資料完整的HNSCC標(biāo)本212例。HNSCC病例中，年齡14～93歲，平均 59.49±14.20歲；口腔 96例，鼻咽部 59例，喉部57例；高分化67例、中分化69例、低分化76例；淋巴轉(zhuǎn)移103例、淋巴無轉(zhuǎn)移109例。212例患者按1997年UICC臨床分期分組，其中Ⅰ期60例、Ⅱ期47例、Ⅲ期62例、Ⅳ期43例；Ⅰ+Ⅱ期為早期組，Ⅲ+Ⅳ期為晚期組。同時手術(shù)中收集頭頸部正常黏膜標(biāo)本84例，其中口腔30例，鼻咽部21例，喉部33例（患者知情同意）。

1.2 主要儀器與試劑

PrP WH2鼠抗人單克隆抗體由中國科學(xué)院武漢病毒研究所病毒學(xué)李朝陽實驗室提供；相關(guān)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。經(jīng)烤片、脫蠟、脫二甲苯、脫水后，再將切片放人3%甲醇雙氧水中封閉10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；清水沖洗后微波抗原修復(fù)20 min；pH為7.3的磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)振洗后滴加一抗（對照組滴加PBS），放人4℃冰箱24 h。PBS振洗后滴加第二抗體，37℃恒溫箱孵育30 min；再次振洗后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育30 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定

染色背景清晰，PrP定位于細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核中，間質(zhì)無染色。以鏡下組織胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕色或者棕黃色染色為陽性標(biāo)準(zhǔn)，并由2位病理學(xué)專家根據(jù)相應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)賦值，其評分標(biāo)準(zhǔn)如下：著色強(qiáng)度分為4個等級：無著色計0分、淺棕黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分。陽性細(xì)胞所占比例分為五個等級：百分比＜5%計0分、6～25%計1分、26～50計2分、51～75%計3分、76～100%計4分。

本研究結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相乘后分級，所得分?jǐn)?shù)為0～1分時，分級為（-）；2～4分為（+）；5～8分為（++）；9～12分為（+++），其中 -為陰性組、+為弱陽性組、++/+++為強(qiáng)陽性組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 17.0軟件，選擇非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney檢驗方法及Kruskal-Wallis檢驗方法分析PrP的表達(dá)強(qiáng)度與HNSCC患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性；并選擇χ2檢驗或Fisher's精確檢驗分析正常黏膜與HNSCC之間的表達(dá)差異及各亞組之間的表達(dá)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PrP在正常黏膜和HNSCC中的表達(dá)

PrP在正常黏膜和HNSCC中的表達(dá)情況見圖1。

圖1 免疫組化PrP在HNSCC不同部位及正常粘膜的表達(dá)情況Fig.1 Expression of PrP in HNSCC and normal mucosa

PrP在各組織表達(dá)主要定位于胞質(zhì)中，并在各分型之間無明顯差異；染色呈棕黃色，同時PrP在腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)（圖1）。

84例正常黏膜組織中有9例呈陽性表達(dá)，陽性率為10.71%；212例HNSCC中有141例呈陽性表達(dá)，陽性率為66.51%，顯著高于正常黏膜(χ2=74.930，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 PrP的表達(dá)強(qiáng)度與相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)系

PrP的表達(dá)強(qiáng)度與相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)系見表1。

表1 PrP在HNSCC中的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The PrP between the expression levels and clinical parameter in HNSCC

由表1可知：

(1)發(fā)生部位：PrP在不同部位的陽性表達(dá)率為口腔 94.79%(91/96)，鼻咽部 28.81%(17/59)，喉部 57.89%(33/57)，PrP在鼻咽部的陽性表達(dá)較之口腔和喉部偏低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=73.884，P=0.000)。

(2)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：PrP在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率分別為54.37%(56/103)和77.98%(85/109)，PrP在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)較之未轉(zhuǎn)移組偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.319，P=0.020)。

(3)正常黏膜、不同分化HNSCC組織：PrP在正常黏膜、高分化、中分化及低分化HNSCC組織中的陽性表達(dá)率10.71%(9/84)和66.51%(141/212)，隨著分化程度下降而升高。同時PrP表達(dá)強(qiáng)度也隨病理分級下降而增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=51.670，P=0.000)。

(4)年齡：PrP在45歲以下，45-65歲和66歲以上患者HNSCC中陽性表達(dá)率分別為59.46%(22/37)、60.44%(55/91)和76.19%(64/84)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.733，P=0.094)。

(5)TNM分期：Ⅰ期60例、Ⅱ期47例、Ⅲ期 62例、Ⅳ期43例，分期之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.103，P=0.007），PrP表達(dá)強(qiáng)度隨 TNM分期分級下降而增高；Mann-Whitney檢驗分析得出PrP在Ⅰ、Ⅱ期中表達(dá)的漸進(jìn)性增強(qiáng)具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.337，P=0.019)，但 PrP在Ⅲ、Ⅳ期中表達(dá)的漸進(jìn)性增強(qiáng)不具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.265，P=0.791)；同時Fisher's精確檢驗得出正常粘膜，早期組Ⅰ+Ⅱ期(58/107)和晚期組Ⅲ+Ⅳ期(83/105)表達(dá)差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=93.362，P=0.000)（表2、表3）。

表2 PrP在Ⅰ期和Ⅱ期中的漸進(jìn)性增強(qiáng)表達(dá)的差異Tab.2 Difference of progressive expression of PrP betweenⅠand Ⅱ TNM stages

表3 PrP在正常黏膜，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)的差異Tab.3 Difference of progressive expression of PrP in normal mucosa，Ⅰ+ⅡandⅢ+Ⅳ TNM stages

3 討論

我國HNSCC（包括喉癌、鼻咽癌、口腔鱗癌等）的發(fā)病率已占頭頸部腫瘤的第1位，且逐年呈上升趨勢[11-13]。但在HNSCC中，特別是晚期腫瘤的患者五年生存率并沒有明顯提高[14]，而HNSCC的發(fā)生發(fā)展是一個長期、多階段過程，至今機(jī)制尚不清楚，所以能否找到HNSCC早期診斷及預(yù)后至關(guān)重要。

本研究通過免疫組化技術(shù)檢測PrP在正常黏膜和HNSCC組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)差異及臨床意義。結(jié)果表明，PrP在以上組織中均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，同時腫瘤組織的陽性率66.51%(141/212)顯著高于正常黏膜10.71%(9/84)，說明PrP與頭頸部的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。PrP在不同部位，淋巴轉(zhuǎn)移，病理分期，TNM分期間的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義；在年齡間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PrP在不同部位的陽性表達(dá)率為口腔94.79%(91/96)，鼻咽部28.81%(17/59)，喉部57.89%(33/57)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且PrP在鼻咽部的陽性表達(dá)較之口腔和喉部偏低，可能是鼻咽部的鱗狀細(xì)胞癌中某種其他機(jī)制導(dǎo)致PrP的表達(dá)下調(diào)所致，有待進(jìn)一步研究。

在HNSCC中對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，口腔鱗狀細(xì)胞癌因上頜血運較下頜豐富、舌體活動多促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，引起下唇和下頜牙齦癌的早期轉(zhuǎn)移較上唇和舌癌少。另外，口腔頜面部的鱗狀細(xì)胞癌因其較早能夠被發(fā)現(xiàn)并治療，所以某些中低分化的下唇及牙齦癌染色強(qiáng)度高但并未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；而舌體、舌根、口咽及上唇癌雖然是高分化型，但已發(fā)生轉(zhuǎn)移。以上因素共同作用導(dǎo)致PrP在淋巴轉(zhuǎn)移組較之為未轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率低。PrP隨著病例分化和臨床分期程度的下降而出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)的趨勢。

病理分型中PrP表達(dá)強(qiáng)度隨分化下降而升高，高分化較中低分化鱗狀細(xì)胞癌染色范圍稍廣，但著色強(qiáng)度較之變淺，這之間的不同可能與腫瘤組織的異型性和癌巢形成有關(guān)，同時有1例低分化鱗狀細(xì)胞癌出現(xiàn)了陰性表達(dá)，可能是PrP在低分化分型中被某種酶或物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為另外一種形式或進(jìn)入胞核未能檢測到，而這一推論是否成立也有待進(jìn)一步研究。臨床TNM分期中，Ⅰ、Ⅱ期腫瘤的PrP表達(dá)強(qiáng)度隨分化下降而升高(P<0.05)，但與Ⅲ、Ⅳ期的差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而在正常黏膜，Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期的總體表達(dá)差異中具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PrP成漸進(jìn)性表達(dá)增高，說明PrP在Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ整體分期中，隨著分期程度下降出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)的趨勢，可見PrP在HNSCC的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的作用。

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