金銀花中綠原酸提取工藝研究

趙昕梅+遠(yuǎn)凌威

摘 要：通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以HPLC法檢測(cè)的綠原酸含量為考察指標(biāo)，對(duì)樣品顆粒大小、提取溶劑、超聲波處理時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。結(jié)果為樣品顆粒過(guò)60目篩，50%甲醇為溶劑，40 ℃水浴超聲處理20 min時(shí)，金銀花中綠原酸提取量最高，為17.015 mg/g，重復(fù)提取2次時(shí)綠原酸提取率為95.57%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于金銀花中綠原酸的提取。

關(guān)鍵詞：金銀花 ?綠原酸 ?提取工藝 ?高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）11（b）-0042-02

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、平肝明目、和抗菌、降壓等功效[1]，其主要活性成分之一綠原酸作為金銀花中酚酸類(lèi)化合物，具有抗菌、抗炎、抗內(nèi)毒素、抗氧化、降血脂、血糖等多種作用[2-3]，在醫(yī)藥、食品和日用化工領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。綠原酸含量被用作評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的指標(biāo)，因此，建立簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的綠原酸提取工藝成為檢測(cè)金銀花質(zhì)量的前提。該文嘗試采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量，超聲波輔助法對(duì)樣品顆粒大小、超聲波處理時(shí)間、提取溶劑和提取次數(shù)等因素進(jìn)行考查，以確定金銀花中綠原酸的最佳提取工藝，為金銀花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（UltiMate3000，戴安），ULUP-Ⅳ優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普），等。乙腈為色譜純（ThermoFisher），金銀花購(gòu)自信陽(yáng)市美銳大藥房。對(duì)照品綠原酸（上海同田，批號(hào)：327-97-9）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備工藝研究

該文對(duì)綠原酸提取過(guò)程中的顆粒大小（A），甲醇體積分?jǐn)?shù)（B），超聲波處理時(shí)間（C）和抽提次數(shù)（D）等4個(gè)主要因素分別進(jìn)行了3個(gè)水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

由表1極差分析可知，當(dāng)以綠原酸的提取量為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，各因素的影響大小依次為B>D>C>A，即提取溶劑（B）對(duì)綠原酸的提取效果影響最為顯著，表現(xiàn)為，水平2>水平3>水平1，為主要因素，應(yīng)取最好水平;樣品提取次數(shù)（D）對(duì)綠原酸提取量的影響僅次于提取溶劑，而樣品顆粒大小和超聲波處理時(shí)間，為次要因素。然而，由同一因素不同水平下綠原酸的平均提取量k值的大小可知，在A因素中，隨著樣品顆粒的變小，綠原酸提取量在樣品過(guò)60目篩時(shí)最好;在C因素中，隨著超聲處理時(shí)間的增加，綠原酸的提取量呈增加趨勢(shì)，而水平1和水平2對(duì)未表現(xiàn)出明顯差異;在D因素中，隨提取次數(shù)的增加綠原酸的提取效果表現(xiàn)為水平3>水平2>水平1，而水平2和水平3差異不大。因此，考慮到操作時(shí)間和成本等原因，各因素的最佳搭配為A2B2C3D2。此方案與正交表中的序號(hào)為5的條件比較接近，通過(guò)補(bǔ)做試驗(yàn)得到綠原酸的平均提取量為17.015 mg/g（表2），比方案5中綠原酸提取量（14.892 mg/g）提高了14.26%，這說(shuō)明方案A2B2C3D2可作為金銀花中綠原酸提取工藝的理想選擇。

綜合正交試驗(yàn)驗(yàn)和補(bǔ)做的單因素試驗(yàn)結(jié)果，金銀花中綠原酸的最佳提取方案為：樣品干燥后研磨成顆粒（60目）1.0 g，加入20 mL 50%甲醇溶液，40 ℃水浴超聲處理20 min，然后10，000 r/min離心5 min，分離液體和組織塊，將液體轉(zhuǎn)移至新的容器中;再用20 mL 50%甲醇溶液懸浮組織塊，40 ℃水浴超聲處理10 min，合并液體部分;利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的液體濃縮，定容10 mL 50%甲醇溶液中，待用。

2.2 色譜條件

該文中所有色譜試驗(yàn)均采用高效液相色譜DIONEX UltiMate?? 3000 （Thermo Scientific，U.S.）系統(tǒng)進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用變色龍分析軟件（revision 6.8， Thermo Scientific，U.S.）。色譜柱：C18柱（Acclaim，250 mm×4.6 mm， 5 μm， Thermo Scientific，U.S.）;流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液（12：88）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm;進(jìn)樣量為20 ?L。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液并定容至50 mL，搖勻并進(jìn)行超聲處理，待藥品完全溶解后即得200 ?g/mL的綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，放入冰箱（4 ℃）待用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將5個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液（100、50、25、12.5、6.25 ?g/mL），按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，變色龍軟件自動(dòng)以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸檢測(cè)濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程為：Y=0.7495X-1.0041，R2=0.9996，結(jié)果表明綠原酸在6.25～100 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取綠原酸對(duì)照品溶液（50 ?g/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.21%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金銀花粉末6份，依照優(yōu)化后的方案進(jìn)行處理，并計(jì)算綠原酸的含量。結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.73%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于樣品制備后0、3、6、9、12 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.49%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取金銀花粉末0.2 g，共12份，其中6份分別加入綠原酸對(duì)照品200 ?g，再按優(yōu)化方案制備供試品溶液，經(jīng)HPLC測(cè)得綠原酸的平均回收率為100.75%，RSD為1.62%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確。endprint

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

精確稱(chēng)取0.2 g金銀花樣品，共9份，每種提取液3個(gè)重復(fù)，并按照最佳提取條件對(duì)其中的綠原酸進(jìn)行提取。由HPLC檢測(cè)結(jié)果（表2）可以看出，在第一次提取液中，熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中，甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g，顯著高于熱水中綠原酸提取量（0.756 mg/g）和50%甲醇中綠原酸提取量（0.907 mg/g）;而第三次提取液中，3種提取液中的綠原酸含量都比較低?？傊?，50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量最高，平均為17.015 mg/g，甲醇次之，為14.815 mg/g。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究得出體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量顯著高于熱水，而且非目標(biāo)物質(zhì)的峰面積較小，有利于綠原酸的進(jìn)一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時(shí)獲得95%以上的綠原酸，因此，為了減少提取液濃縮過(guò)程中的能耗和提高工作效率，可以只選擇2次提取操作。

樣品顆粒大小和超聲波處理時(shí)間直接影響到物質(zhì)的溶出效果，但是顆粒過(guò)小則會(huì)增加樣品的處理難度，綠原酸得率與超聲波處理時(shí)間關(guān)系不顯著，反而延長(zhǎng)處理時(shí)間會(huì)增大提取溶液粘度，尤其是熱水作為提取溶劑時(shí)。

總之，金銀花樣品干燥至恒重后，研磨，顆粒過(guò)60目篩，50%甲醇為溶劑，40 ℃水浴超聲處理20 min時(shí)，綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：295.

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[3] Hebeda CB，Bolonheis SM，Nakasato A，et al.Effects of chlorogenic acid on neutrophil locomotion functions in response to inflammatory stimulus[J].J Ethnopharmacology，2011，135（2）： 261-269.endprint

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

精確稱(chēng)取0.2 g金銀花樣品，共9份，每種提取液3個(gè)重復(fù)，并按照最佳提取條件對(duì)其中的綠原酸進(jìn)行提取。由HPLC檢測(cè)結(jié)果（表2）可以看出，在第一次提取液中，熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中，甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g，顯著高于熱水中綠原酸提取量（0.756 mg/g）和50%甲醇中綠原酸提取量（0.907 mg/g）;而第三次提取液中，3種提取液中的綠原酸含量都比較低。總之，50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量最高，平均為17.015 mg/g，甲醇次之，為14.815 mg/g。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究得出體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量顯著高于熱水，而且非目標(biāo)物質(zhì)的峰面積較小，有利于綠原酸的進(jìn)一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時(shí)獲得95%以上的綠原酸，因此，為了減少提取液濃縮過(guò)程中的能耗和提高工作效率，可以只選擇2次提取操作。

樣品顆粒大小和超聲波處理時(shí)間直接影響到物質(zhì)的溶出效果，但是顆粒過(guò)小則會(huì)增加樣品的處理難度，綠原酸得率與超聲波處理時(shí)間關(guān)系不顯著，反而延長(zhǎng)處理時(shí)間會(huì)增大提取溶液粘度，尤其是熱水作為提取溶劑時(shí)。

總之，金銀花樣品干燥至恒重后，研磨，顆粒過(guò)60目篩，50%甲醇為溶劑，40 ℃水浴超聲處理20 min時(shí)，綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。

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2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

精確稱(chēng)取0.2 g金銀花樣品，共9份，每種提取液3個(gè)重復(fù)，并按照最佳提取條件對(duì)其中的綠原酸進(jìn)行提取。由HPLC檢測(cè)結(jié)果（表2）可以看出，在第一次提取液中，熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中，甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g，顯著高于熱水中綠原酸提取量（0.756 mg/g）和50%甲醇中綠原酸提取量（0.907 mg/g）;而第三次提取液中，3種提取液中的綠原酸含量都比較低?？傊?0%甲醇作為提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量最高，平均為17.015 mg/g，甲醇次之，為14.815 mg/g。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究得出體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時(shí)，綠原酸提取量顯著高于熱水，而且非目標(biāo)物質(zhì)的峰面積較小，有利于綠原酸的進(jìn)一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時(shí)獲得95%以上的綠原酸，因此，為了減少提取液濃縮過(guò)程中的能耗和提高工作效率，可以只選擇2次提取操作。

樣品顆粒大小和超聲波處理時(shí)間直接影響到物質(zhì)的溶出效果，但是顆粒過(guò)小則會(huì)增加樣品的處理難度，綠原酸得率與超聲波處理時(shí)間關(guān)系不顯著，反而延長(zhǎng)處理時(shí)間會(huì)增大提取溶液粘度，尤其是熱水作為提取溶劑時(shí)。

總之，金銀花樣品干燥至恒重后，研磨，顆粒過(guò)60目篩，50%甲醇為溶劑，40 ℃水浴超聲處理20 min時(shí)，綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。

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