煙草青枯病菌生防菌的篩選和鑒定

畢濤+劉群+王曉強(qiáng)+李向東+陳曉紅+溫亮+蘇建東+楊舉田

摘 要：采用紙碟片法篩選到4株對(duì)煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b，抑菌圈直徑分別為51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。通過(guò)16S rDNA序列分析，C2c、C1a和Tsb為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），Ch1b為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）。這4株生防菌對(duì)煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）等病原真菌也有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：煙草青枯病菌；生防菌；紙碟片法

中圖分類號(hào)：S435.72+S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）11-0068-04

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是煙草上最具毀滅性的細(xì)菌性病害，已經(jīng)成為我國(guó)煙葉生產(chǎn)的主要制約因素。

煙草青枯病的生物防治越來(lái)越引起重視?？追裁鞯龋?999）[1]認(rèn)為生防菌可以減輕發(fā)病程度，在接種青枯菌前噴施生防菌防病效果更好。羅寬等（2002）[2]篩選到3株青枯菌拮抗菌，并通過(guò)大田試驗(yàn)驗(yàn)證其防效。尹華群等（2004）[3]篩選到1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及2株短芽孢桿菌（Bacillus brevis）。張伏軍等（2007）[4]、胡軍華等（2009）[5]分離到1株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），盆栽試驗(yàn)表明，先施用生防菌菌液或活性物質(zhì)的防治效果要高于農(nóng)用鏈霉素，后施菌液或活性物質(zhì)也有一定的防治效果。段燕平等（2012）[6]分離得到1株枯草芽孢桿菌（B. subtilis），防治效果達(dá)66.70%。

本研究希望篩選更多的生防菌，鑒定其種屬地位并測(cè)定其抑菌譜，為煙草青枯病的生物防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病菌 煙草青枯病菌、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；白地霉（Geotrichum candidum）由密西西比州立大學(xué)呂士恩老師提供；煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）和蘋果炭疽病菌（Gleosporium fructigenum）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張廣民老師提供。

1.1.2 菌株、載體和生化試劑 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTPs、DNA Marker（Trans 2K Plus，Trans 15K Plus）等購(gòu)自全式金公司。其它生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草青枯病菌生防菌篩選 將滅菌的150 mL NA 固體培養(yǎng)基加熱溶化完全，冷卻至55℃左右，倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mL，凝固后備用。

根據(jù)袁從陽(yáng)（2010）[7]的方法篩選生防菌株。采集小麥和煙草根際土壤，制備菌懸液，均勻涂布在NA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)24 h。將孢子濃度為1.0×105個(gè)/mL的白地霉（Geotrichum candidum）孢子懸液均勻噴布在長(zhǎng)出細(xì)菌菌落的NA平板上，28℃培養(yǎng)24 h。選取周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈的菌落，劃線法純化生防菌株。

采用紙碟片法驗(yàn)證生防菌株對(duì)煙草青枯病菌的生防活性。在NA培養(yǎng)基平板中央放置直徑為7 mm的無(wú)菌紙碟片，用微量移液器在紙碟片上滴加濃度為1.0×108 cfu/mL的生防菌菌懸液10 μL，以無(wú)菌水為對(duì)照，待培養(yǎng)基充分吸收后，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱24 h。將平板轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥，用濃度為1.0×108 cfu/mL的煙草青枯病菌菌懸液均勻噴灑在平板表面，使霧化菌懸液自然散落于藥劑平板上。待平板充分吸收菌懸液后封口，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24、48 h后檢查抑菌效果，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，記錄抑菌圈透明度，篩選抑菌效果突出的生防菌株。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)菌株每次3個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列測(cè)定和分析 利用天根細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒提取對(duì)煙草青枯病菌有明顯抑制作用的生防菌株的全基因組DNA。利用引物16S-8-F（5′-CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3′）和16S-1510-R（5′-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3′）擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因。擴(kuò)增體系為：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/ L）1.0 μL，16S-8-F （10 moL/L） 1.0 μL，16S-1510-R （10 moL/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.125 μL，加ddH2O至終體積25.0 μL。以ddH2O替代模板的體系作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 產(chǎn)物置于0.8% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，然后在凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。切膠回收目的片段，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒，送測(cè)序公司測(cè)序。將序列在NCBI上BLAST，并將其與GenBank序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。endprint

1.2.3 生防菌對(duì)病原真菌的抑菌作用 將滅菌的150 mL PDA 固體培養(yǎng)基加熱溶化完全，冷卻至55℃左右，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mL，凝固后備用。

采用紙碟法，在預(yù)先準(zhǔn)備的直徑為90 mm的PDA平板上均勻?qū)ΨQ放置直徑為7 mm的紙碟片，在紙碟片上滴加濃度為1.0×108 cfu/mL的生防菌菌懸液10 μL，待培養(yǎng)基將生防菌充分吸收后，倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將平板轉(zhuǎn)移到通風(fēng)櫥內(nèi)噴施濃度1.0×105個(gè)/mL供試病原真菌（見表1）孢子懸浮液，密封并將其轉(zhuǎn)移到28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。以不加生防菌液的紙碟為對(duì)照。每菌株重復(fù)3皿。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病菌生防菌篩選

通過(guò)初篩，從100多個(gè)樣品中得到24株有拮抗作用的菌株，利用紙碟法篩選到4株對(duì)煙草青枯病菌有良好抑制作用的拮抗菌株。接種煙草青枯病菌24 h后，生防菌株C2c的抑菌圈直徑達(dá)到51.50 mm，抑菌圈半透明； C1a、Tsb和Ch1b抑菌圈直徑分別為25.95、24.40 mm和20.05 mm，抑菌圈透明。接種煙草青枯病菌48 h后，生防菌株Tsb和C1a對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑?jīng)]有變化，但透明度變?yōu)榘胪该?；生防菌株C2c和Ch1b的抑菌圈大小和透明度都沒(méi)有變化。

2.2 生防菌16S rDNA序列測(cè)定和分析

通過(guò)PCR，擴(kuò)增到C2c、C1a、Tsb和Ch1b的16S rDNA目的片段，大小約為1 500 bp。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)：C2c、C1a和Tsb的16S rDNA序列為1 517 nt，BLAST結(jié)果顯示，其與多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）16S rDNA序列一致率最高；Ch1b的16S rDNA序列為1 504 nt，與成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）序列一致率最高。從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以發(fā)現(xiàn)，生防菌C2c、C1a和Tsb 與多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）聚類到一支（圖1），Ch1b與成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）聚類到一支（圖2）。

2.3 生防菌對(duì)病原真菌的抑菌作用

Tsb對(duì)玉米小斑病菌和玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為33.70 mm和30.05 mm，對(duì)煙草赤星病菌和煙草根黑腐病菌也有很好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為29.40 mm和27.50 mm；C1a對(duì)玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為32.75 mm，其次為煙草根黑腐病菌和煙草赤星病菌，抑菌圈直徑分別為28.05 mm和27.75 mm；C2c對(duì)玉米彎孢霉病菌的抑菌圈直徑為30.05 mm，對(duì)煙草根黑腐病菌和煙草赤星病菌的抑菌圈直徑分別達(dá)28.40 mm和24.75 mm，另外，其對(duì)蘋果霉心病菌和玉米小斑病菌也有很好的抑菌效果；Ch1b 對(duì)玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為24.00 mm，對(duì)其他病原菌有一定的抑菌效果，對(duì)煙草赤星病菌和煙草根黑腐病菌的抑菌圈直徑分別為16.40 mm和12.00 mm。

3 討論

多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）在多種作物上有促生及抑菌抗病作用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已將多粘類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種[8]。Egamberdiyeva（2007）[9]證實(shí)多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）可促進(jìn)玉米對(duì)氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收從而起到促生作用。已有報(bào)道稱，多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）對(duì)包括黃瓜枯萎病和番茄枯萎病[10]、油菜腐爛病[11]和番茄青枯病[12]在內(nèi)的多種病害有防治作用。本研究從小麥和煙草根際土壤中分離到3株多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa），室內(nèi)試驗(yàn)證明其對(duì)煙草青枯病菌（R. solanacearum）有很好的抑制作用，對(duì)包括煙草赤星病菌（A. alternate）、蘋果霉心病菌（T. roseum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）在內(nèi)的多種病原真菌都有很好的抑制作用。

沈德龍等（2000）[13]鑒定1株對(duì)水稻有很好促生效果的水稻內(nèi)生優(yōu)勢(shì)菌為成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）。洪永聰?shù)龋?001）[14]從稻谷上分離得到2株水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）拮抗菌，1株成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）和1株分散泛菌（Pantoea dispersa）。薛夢(mèng)林（2006）[15]篩選到1株冬棗采后病菌細(xì)交鏈格孢（Alternaria alternata）的拮抗菌，鑒定為成團(tuán)泛菌（P. agglomerans），它可明顯降低棗果采后發(fā)病率，且與藥劑撲海因混用后，防病效果更好。本研究首次報(bào)道了成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）對(duì)煙草青枯病菌（R. solanacearum）的抑菌作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

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