RP-HPLC法測定利腦心膠囊中丹參素的含量

胡 輝，彭 燕，張 倩（解放軍474醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830013）

利腦心膠囊是由丹參、赤芍、粉葛、川芎等15味中藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝加工而成。具有活血化瘀、行氣化痰、通絡(luò)止痛之功效，臨床上主要用于冠心病、心肌梗死、腦動脈硬化[1]等疾病的治療。丹參是本制劑的君藥，其主要有效成分有丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛等。丹參素具有顯著的改善血液流變學(xué)、降脂質(zhì)、抑制脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤和臟器損傷保護等藥理活性[2]，對于治療心腦血管類疾病有著重要意義。中藥制劑成分復(fù)雜，其主要療效不是某單一成分，而是有效部位群，目前，利腦心膠囊是以丹酚酸B作為定量檢測指標(biāo)，而對制劑中丹參素的含量測定方法尚未見報道。本文建立RP-HPLC法測定制劑中丹參素的含量，以期為進一步完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津國際貿(mào)易有限公司）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；CQ-250型超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

丹參素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110855-201210）；利腦心膠囊（吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，批號1111007、1109001、1208003、1207001）；甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%冰醋酸（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量： 10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取丹參素鈉對照品約5.80 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含1.16 mg（相當(dāng)于丹參素1.058 mg）的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取利腦心膠囊10粒，將其內(nèi)容物混合均勻后，取內(nèi)容物細粉約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）50 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，放置片刻，離心，精密吸取上清液25 mL，將溶劑揮干，加水約15 mL，完全溶解后將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用稀鹽酸調(diào)pH值至2，加氯化鈉1.5 g，搖勻使溶解后，用乙酸乙酯萃取4次，每次30 mL，合并萃取液，濃縮至干，殘渣中加少量50%甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)溶至25 mL的量瓶中，定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按照利腦心膠囊的處方及制備工藝，制備不含丹參的陰性對照樣品，再按供試品溶液的方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，陰性樣品對樣品測定無干擾。理論塔板數(shù)按丹參素峰計算不低于3000，色譜圖見圖1。

圖1 利腦心膠囊中丹參素的HPLC色譜圖A – 對照品，B – 供試品，C – 陰性對照；1 – 丹參素Fig 1 HPLC chromatograms of tanshinol in Linaoxin capsule A – reference substance, B – sample, C – negative reference substance;1 – tanshinol

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下的丹參素對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以丹參素濃度（X）對峰面積值（Y）進行線性回歸，得回歸方程為：Y = 7 546.57X – 15 352.60（r = 0.999 7，n = 6）。結(jié)果表明，丹參素在10.58 ～ 105.80 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密吸取同一濃度為21.16 μg·mL-1的丹參素對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積值。結(jié)果顯示，RSD為0.17%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

取利腦心膠囊內(nèi)容物（批號1111007），按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.1”項下色譜條件下進行測定，丹參素含量的平均值為27.26 μg·mL-1，RSD為 1.54%（n = 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取利腦心膠囊內(nèi)容物（批號1111007），按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，室溫靜置，按“2.1”項下色譜條件檢測，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定峰面積值，RSD為0.19%（n = 6）。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實驗

取已知含量的利腦心膠囊（批號1111007，含丹參素0.272 0 mg·g-1）內(nèi)容物適量，研細，取6份，每份約1.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入丹參素對照品溶液（0.350 1 mg·mL-1）1 mL及50%甲醇49 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.51%，RSD為1.60%（n = 6）。詳見表1。

表1 丹參素回收率實驗測定結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for tanshinol. n = 9

2.9 樣品含量測定

取4批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計算丹參素的含量，平均值為0.360 8 mg·g-1詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

目前丹參素的含量測定方法主要有紙層析比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光分光光度法[3-4]等。因本品含有15味中藥材，成分復(fù)雜，故采用RP-HPLC法測定制劑中丹參素的含量，本方法具有分離效能高、靈敏、準確，方法簡便、重現(xiàn)性好等特點。

3.1 檢測波長的選擇

取對照品溶液，在200 ～ 400 nm范圍內(nèi)掃描，丹參素最大吸收波長在280 nm處，故選擇280 nm作為檢測波長。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

本文分別考察了提取溶媒（水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇），超聲處理時間（20、30、40、50 min）及乙酸乙酯萃取次數(shù)（3次、4次、5次）。結(jié)果表明，用50%甲醇為提取溶媒，超聲處理50 min，乙酸乙酯萃取4次時，丹參素的提取含量最高。

3.3 流動相的選擇

分別考察了乙腈-1.2%冰醋酸、甲醇-水-磷酸、甲醇-1%冰醋酸系統(tǒng)等洗脫體系[5-10]，比較分離效果，結(jié)果顯示，以甲醇-1%冰醋酸（10∶90）為流動相，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃的條件下，丹參素色譜峰形及分離度均較好。