復(fù)脈湯對急性心肌缺血大鼠肌鈣蛋白及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

龔一萍，沈煒毅

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053）

急性心肌缺血最常見的原因是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致冠狀動脈管腔狹窄或閉塞，以及在狹窄的基礎(chǔ)上發(fā)生冠狀動脈痙攣而出現(xiàn)急性或慢性心肌供血不足［1］?，F(xiàn)代研究證實(shí)，益氣活血中藥可以促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)，改善心功能［2-3］。在前期的臨床驗(yàn)證中顯示，自擬復(fù)脈湯能明顯改善氣虛血瘀型冠心病患者胸悶胸痛、氣短乏力等癥狀，心電圖ST-T改變有效率在90%以上。由于復(fù)脈湯抗心肌缺血的作用機(jī)制尚不清楚，故本研究擬觀察復(fù)脈湯對實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠肌鈣蛋白及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，探討其抗心肌缺血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠（雄性）58只，生產(chǎn)許可證號：（2008001638685），體重 290g～300g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔飼養(yǎng)室保持恒溫（20℃），相對濕度40%～60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 單味中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部提供。復(fù)脈湯（主要由炙黃芪20g，生曬參10g，麥冬 12g，五味子 6g，丹參 15g，川芎 10g，紅花10g，紅景天10g，雞血藤30g等組成）加水煎煮2次（第1次1.5h，第2次0.5h），制備成生藥，濃度為3.75g/mL；炙甘草湯（炙甘草、生姜、桂枝、黨參、生地黃、阿膠、麥冬、麻子仁、大棗）水煎濃縮至2g/mL，放入4℃冰箱；酒石酸美托洛爾（50mg/片，批號：H32025390）由阿斯利康制藥有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 3%戊巴比妥鈉（美國Sigma，Sigma-P3761），大鼠肌鈣蛋白I（cTnⅠ）ELISA檢測試劑盒（杭州誠維生物科技有限公司，批號：E2014042103）。小動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司ALc-V9），小動物多道生理記錄儀（法國 ekma），離心機(jī)（AllegraX-15R），日立7020全自動生化分析儀（0500790S），冷凍高速離心機(jī)（Thermo），多功能酶標(biāo)儀（Thermo），生化培養(yǎng)箱，萊卡UC7超薄切片機(jī)（0902332S），透射電子顯微鏡（日立H-7650）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 58只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，即復(fù)脈湯高、中、低劑量組，模型組、炙甘草湯組、酒石酸美托洛爾組（美托洛爾組）、假手術(shù)組。除模型組10只外，其余各組每組8只。假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水；復(fù)脈湯高劑量組（37.5g/kg）、復(fù)脈湯中劑量組（18.75g/kg）、復(fù)脈湯低劑量組（9.375g/kg）、炙甘草湯組（20g/kg）、美托洛爾組（10mg/kg）每天給予相應(yīng)藥物灌胃1次，共計(jì)2w。

1.2.2 模型制備 除假手術(shù)組外參考文獻(xiàn)［4］方法稍做改動制備模型。具體步驟為：以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部與胸部皮膚去毛，常規(guī)消毒、鋪巾。逐層分離皮膚、肌肉，暴露氣管，開胸前氣管插管，連接動物呼吸機(jī)行人工呼吸。四肢皮下連接心電圖電極，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在胸骨左側(cè)3、4肋骨處切開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，用開瞼器撐開胸腔，剝離心包膜，暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐間，左心耳下方約2mm，用0/6號縫合針，進(jìn)針深度控制在0.1cm左右，結(jié)扎冠狀動脈左前降支。結(jié)扎后迅速清除胸腔內(nèi)多余血液，觀察心電圖變化，以心電圖ST段立即抬高及結(jié)扎線以下心肌顏色蒼白為造模成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余步驟相同。

1.2.3 檢測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠腹主動脈取血，3000r/min離心20min，分離血清，采用ELISA法檢測血清中肌鈣蛋白Ⅰ的濃度。在預(yù)先包被肌鈣蛋白Ⅰ抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，溫育并徹底洗滌。用底物3，3′，5，5′—四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethyi benzidine，TMB）顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的肌鈣蛋白Ⅰ含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.2.4 心肌組織的電鏡觀察 取左前壁心尖上方5mm處心肌組織，立即投入預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定，經(jīng)PBS漂洗3次，四氧化鋨固定后，用乙醇溶液（50%、70%、80%、90%、95%）梯度脫水，丙酮包埋滲透，加熱聚合，超薄切片修塊，用透射電鏡在12000倍下觀察各組心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響

左前降支結(jié)扎成功率為100%，在手術(shù)中模型組死亡2只，炙甘草湯組死亡1只，余均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。各組大鼠血清cTnⅠ濃度檢測結(jié)果，見表1。

表1 復(fù)脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響 （±s）

表1 復(fù)脈湯對急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ濃度的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與炙甘草湯組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 n cTnⅠ（pg/mL）假手術(shù)組 8 322.68±15.431）模型組 8 511.51±29.81復(fù)脈湯高劑量組 8 426.76±37.371）3）復(fù)脈湯中劑量組 8 449.55±31.301）2）復(fù)脈湯低劑量組 8 460.43±37.651）炙甘草湯組 7 489.99±49.59美托洛爾組 8 430.52±30.811）3）

由表1可知，假手術(shù)組血清cTnⅠ濃度顯著低于模型組（P<0.01）；與模型組比較，復(fù)脈湯各劑量組、美托洛爾組大鼠血清cTnⅠ濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與炙甘草湯組比較，復(fù)脈湯中、高劑量組、美托洛爾組血清cTnⅠ濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；復(fù)脈湯各劑量組與美托洛爾組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 對心肌缺血大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

各組大鼠心肌組織的電鏡觀察，結(jié)果見圖1。模型組：心肌細(xì)胞Z線清晰可見，明暗帶清楚可辨，肌原纖維斷裂、扭曲、縮短，肌絲束間線粒體明顯增多，排列紊亂，體積增大，嵴突破壞、斷裂、溶解，空泡形成。假手術(shù)組：心肌細(xì)胞Z線尚規(guī)則，肌小節(jié)清晰，肌絲排列規(guī)則、整齊，線粒體在肌絲束排列成單排，線粒體嵴完整。復(fù)脈湯高劑量組：心肌細(xì)胞Z線清楚，肌原纖維基本規(guī)則，局部心肌纖維破壞溶解，線粒體基本完好，在肌絲束間多成單排，嵴突無破壞。復(fù)脈湯中劑量組：肌原纖維排列基本規(guī)則，局部心肌纖維有溶解滲出，較高劑量組明顯，線粒體基本完好，嵴突無破壞，少量線粒體進(jìn)入破壞溶解區(qū)。復(fù)脈湯低劑量組：心肌纖維排列基本整齊，Z線明顯，線粒體形態(tài)不規(guī)則，部分心肌纖維斷裂，扭曲變形。炙甘草湯組：Z線明顯，明暗帶清楚，心肌纖維排列欠規(guī)則，部分肌小節(jié)斷裂，出現(xiàn)收縮帶，閏盤結(jié)構(gòu)輕度破壞，線粒體排列不規(guī)則，線粒體嵴突破壞、斷裂、溶解，空泡形成。美托洛爾組：肌原纖維排列尚規(guī)則，少量纖維斷裂溶解，局部滲出，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。

圖1 各組心肌組織電鏡結(jié)果

3 討論

當(dāng)冠脈的供血與心肌的需血之間發(fā)生矛盾，冠脈血流量不能滿足心肌代謝的需要時，就會引起心肌缺血缺氧。急劇的、暫時的缺血缺氧可引起心絞痛，而持續(xù)的、嚴(yán)重的心肌缺血可引起心肌壞死及心肌梗死。心肌梗死病死率較高，占心臟病死亡率的50%～70%。如何防治心肌缺血，有重大的臨床意義。實(shí)驗(yàn)中觀察的肌鈣蛋白Ⅰ（Cardiac TroponInⅠ，cTnⅠ）僅存在于心肌收縮蛋白的細(xì)肌絲上，調(diào)節(jié)肌肉的收縮與舒張。在心肌細(xì)胞缺血損傷的早期，即可引起血清cTnⅠ水平顯著升高。觀察cTnⅠ的變化，可以了解心肌缺血的損傷程度［5］。因此cTnⅠ可作為心肌缺血、損傷、壞死及急性冠脈綜合征的敏感指標(biāo)，心肌細(xì)胞缺血受損越嚴(yán)重，外周血清中肌鈣蛋白Ⅰ含量越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：復(fù)脈湯高、中、低劑量組cTnⅠ的濃度與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明復(fù)脈湯對急性心肌缺血的保護(hù)作用可能與降低外周血cTnⅠ的濃度有關(guān)，且復(fù)脈湯對心肌缺血的保護(hù)作用呈劑量依賴性。

本研究中復(fù)脈湯為臨床自擬方，以益氣活血化瘀立法，治以益氣治本為主，活血通絡(luò)治標(biāo)為次，氣行則血行，血行則無瘀，氣血通暢，則心神得寧，故病霍然而愈。現(xiàn)代研究證實(shí)，益氣活血中藥具有良好的抗心肌缺血作用。李龍等［6］臨床研究發(fā)現(xiàn)益氣活血化瘀法能明顯改善中醫(yī)辨證屬氣虛血瘀型冠心病患者的心絞痛癥狀以及心電圖缺血程度。手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈左前降支損傷心氣，心氣虛乏，無力推動血行，血脈瘀滯，故而出現(xiàn)氣虛血瘀的狀態(tài)。重用黃芪以助心氣，并與生曬參相須為用，增強(qiáng)補(bǔ)益心氣、推動血行的功效。結(jié)扎冠脈，血流受阻，加重血瘀的形成，丹參、紅花活血養(yǎng)血，可擴(kuò)張冠脈，改善冠心病血液流變學(xué)。川芎為血中之氣藥，雞血藤活血養(yǎng)血通絡(luò)，有助于血脈的通利，減輕心肌細(xì)胞的缺氧損傷。美托洛爾為β受體阻滯劑，能夠減慢心率，降低心肌耗氧，減輕心肌缺血損傷，降低外周血cTnⅠ濃度。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)脈湯各劑量組與美托洛爾組之間血清cTnⅠ濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

心肌缺血同時還表現(xiàn)為心肌組織超微結(jié)構(gòu)的損害，主要表現(xiàn)為肌原纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂、斷裂、溶解、短縮以及線粒體結(jié)構(gòu)破壞。正常的心肌細(xì)胞，肌原纖維是心肌細(xì)胞的最小單元體，線粒體結(jié)構(gòu)破壞是細(xì)胞損害的最敏感指標(biāo)。復(fù)脈湯各劑量組與美托洛爾組冠脈結(jié)扎所致的心肌超微結(jié)構(gòu)損害明顯減輕，肌原纖維排列基本有序，線粒體結(jié)構(gòu)完整。

綜上所述，復(fù)脈湯改善心肌缺血的機(jī)制可能與降低缺血心肌細(xì)胞cTnⅠ的釋放、減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損害有關(guān)。

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