重樓皂苷對肝纖維化大鼠纖維化標志物的影響及其相關(guān)性分析

洪 燕 ，韓燕全 ，羅 歡 ，桂 潔 ，張 凱 ，姜 輝

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥 230031）

我國約有1億左右乙型病毒性肝炎（HBV）攜帶者，肝硬化的發(fā)病率逐年增高［1-2］。肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)之路，因此阻止肝纖維化的發(fā)展，對于肝硬化的防治至關(guān)重要。中醫(yī)藥對肝纖維化的治療有較明顯的優(yōu)勢，中藥重樓臨床應(yīng)用于抗乙肝病毒合劑等多個治療慢性乙型肝炎的方劑中，其保肝、抗病毒療效確切［3］。課題組前期進行了重樓對化學性及免疫性肝損傷小鼠的實驗研究，同時對重樓保肝作用的有效部位進行了篩選實驗，結(jié)果表明重樓對急性肝損傷小鼠具有一定的保護作用，皂苷為其主要有效部位［4-6］。本文通過重樓皂苷干預CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠的實驗，探討其抗纖維化作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 重樓皂苷為實驗室自制，以薯蕷皂苷元為對照，按紫外分光光度法于408nm測定其含量為54.23%；參照《中華人民共和國藥典》2010版對其有效成分進行測定，本品含重樓皂苷Ⅰ和Ⅱ總量為0.83%。復方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司），秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責任公司）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）及羥脯氨酸（HYP）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，批號分別為：C009-2，C010-2，75024R，59624R，78025R，75263R，A030-2。

1.1.2 實驗動物 普通級SD雄性大鼠，體重（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 實驗儀器 安捷倫8453-E型紫外分光光度計（安捷倫儀器有限公司），JW3021HR離心機（安徽嘉文），GL-88B漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司），DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發(fā)）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機分為7組，即：正常組、模型組、復方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組和重樓皂苷高、中、低劑量組，每組各10只。除正常組外，其他各組大鼠采用經(jīng)典的CCl4致肝纖維化造模。具體方法為：按0.1mL/100g體重皮下注射 CCl4橄欖油溶液（CCl4∶橄欖油=5∶5），2次/w，共 12w，正常組皮下注射橄欖油［7-8］。

1.2.2 給藥 第7周起，各組每天灌胃1次；正常組灌胃蒸餾水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，即秋水仙堿組劑量為0.1mg/kg，復方鱉甲軟肝片組劑量為540mg/kg，重樓皂苷高、中、低劑量組劑量分別為300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg。

1.2.3 標本采集與處理 末次給藥后，禁食8h，處死大鼠，取血，離心機分離血清，-20℃保存。稱取肝組織300mg，-20℃保存。用ELISA法分別檢測各指標。血清ALT、AST含量測定：檢測方法按試劑盒說明書進行。血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ含量測定：檢測方法按試劑盒說明書進行。肝組織HYP含量測定：組織解凍后，用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿，檢測方法按試劑盒說明書進行。肝組織病理觀察：取肝組織0.5g～1g，常規(guī)固定包埋，HE染色，普通光鏡觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST和肝組織HYP含量的影響

與正常組比較，模型組血清ALT、AST含量，肝組織HYP含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，各治療組血清ALT、AST含量，肝組織HYP含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

表1 重樓皂苷對肝纖維化大鼠ALT、AST、HYP的影響 （±s）

表1 重樓皂苷對肝纖維化大鼠ALT、AST、HYP的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L） HYP（μg/L）正常組 10 - 50.06±7.26 41.99±10.95 220.28±41.87模型組 10 - 96.81±23.122） 89.87±18.222） 380.45±76.442）復方鱉甲軟肝片組 10 540 70.29±13.892） 72.21±10.582） 238.25±68.202）秋水仙堿組 10 0.1 71.33±9.782） 64.30±15.872） 266.86±54.242）重樓皂苷高劑量組 10 300 72.14±7.122） 66.17±12.162） 261.03±55.812）重樓皂苷中劑量組 10 150 76.81±12.572） 75.51±4.611） 292.95±49.942）重樓皂苷低劑量組 10 75 79.25±9.351） 76.72±6.731） 314.17±46.571）

2.2 血清ALT、AST、肝組織HYP與肝纖四項相關(guān)性分析［9］

結(jié)果見表2。

表2 ALT、AST、HYP與肝纖四項相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明：ALT、AST、HYP與肝纖4項指標之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 重樓皂苷對肝纖維化大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量的影響

與正常組比較，模型組血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表3。

2.4 重樓皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響

正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉清晰，肝細胞排列規(guī)則；模型組局部肝細胞脂肪變性明顯，形態(tài)不規(guī)則，排列雜亂，且有炎細胞浸潤，組織間有大量纖維增生，有假小葉形成；復方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度有所減輕，仍能觀察到脂肪樣變性肝細胞；重樓皂苷高劑量組肝小葉可見，肝細胞結(jié)構(gòu)基本正常，有少量炎細胞浸潤和脂肪變性，纖維增生不明顯，與秋水仙堿組病變相當；重樓皂苷中、小劑量組纖維增生，特別在小劑量組中可見纖維環(huán)繞，似假小葉存在，組織仍以肝細胞脂肪變性和炎細胞浸潤為主要病變。結(jié)果見圖1。

表3 重樓皂苷對肝纖維化大鼠肝纖四項的影響 （±s）

表3 重樓皂苷對肝纖維化大鼠肝纖四項的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（mg/kg） HA（ng/L） LN（μg/L） CⅣ（μg/L） PCⅢ（μg/L）正常組 10 - 87.75±14.122） 96.82±15.832） 69.57±8.472） 68.31±6.992）模型組 10 - 180.35±14.82 226.54±41.28 115.35±17.07 97.73±13.59復方鱉甲軟肝片組 10 540 96.83±9.832） 152.91±25.892） 77.09±19.012） 82.55±10.182）秋水仙堿組 10 0.1 97.22±11.682） 104.70±17.002） 80.51±26.522） 77.61±7.182）重樓皂苷高劑量組 10 300 123.28±11.452） 108.80±13.752） 86.42±21.242） 68.86±4.142）重樓皂苷中劑量組 10 150 124.50±17.722） 148.35±4.212） 93.68±21.441） 82.11±7.712）重樓皂苷低劑量組 10 75 117.99±37.952） 168.47±20.672） 114.83±14.08 85.26±14.791）

圖1 重樓皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響（HE×400）

3 討論

重樓為百合科草本植物，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效［10］。現(xiàn)代研究表明其藥理作用廣泛，如抗腫瘤、抗病毒、止血、消炎等作用。目前對重樓的研究多關(guān)注其抗癌方面的作用，而對肝纖維化方面的研究筆者至今未見報道。

課題組前期進行了重樓保肝實驗和有效部位篩選研究，表明重樓提取物有較明確的保肝作用，而重樓皂苷為其主要有效部位。故本實驗分別以中藥復方鱉甲軟肝片和西藥秋水仙堿作為陽性對照藥，觀察重樓皂苷對肝纖維化大鼠血清及肝組織相關(guān)纖維化標志物的影響，進一步探討重樓對肝纖維化大鼠的保護作用，為其開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，其病理基礎(chǔ)主要是肝組織中大量的細胞外基質(zhì)過度沉積，而細胞外基質(zhì)主要來源于肝星狀細胞（HSC），研究認為HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。激活的HSC分泌HA，釋放至血竇中，因此血清中HA的含量可以直接反映HSC的活化程度，也間接反映了肝纖維化的進展。除了HA之外，LN、PCⅢ、CⅣ，也是反映細胞外基質(zhì)沉積程度的血清標志物［11］，常合稱四者為“肝纖四項”。這些血清標志物中，HA的特異性較高，其余并不是肝纖維化特有的，在肺纖維化、腎臟疾病中也可見異常升高。故本實驗同時檢測了血清ALT、AST的含量以及肝組織HYP的含量，并對指標間的相關(guān)性進行分析，以便對肝纖維化做出更加客觀的診斷和評價。

ALT和AST是人體代謝過程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細胞中，當肝細胞變性壞死或細胞膜受到損害時，即可釋放入血。1%的肝細胞受到損害，可使血液中ALT的濃度增加1倍。因此，血液ALT水平是反映肝臟是否受到損害的敏感指標，而AST升高的程度與肝細胞受損的程度相一致。本實驗結(jié)果顯示，重樓皂苷能顯著降低肝纖維化大鼠血清中ALT及AST含量，提示其能減輕肝纖維化進程中的肝細胞損傷，對肝臟有一定保護作用。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ALT、AST 與 HA、LN、CⅣ、PCⅢ之間在0.01水平上顯著相關(guān)，隨著轉(zhuǎn)氨酶的降低，肝纖四項指標也隨之降低。這一變化也與肝組織病理結(jié)果相一致，即光鏡下觀察HE切片，可見隨著這些血清標志物的降低，肝纖維化程度有不同程度改善，重樓皂苷高劑量組改善程度與復方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組相當，中、小劑量組改善程度不及復方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組。

在肝纖維化的形成和發(fā)展中，以膠原蛋白為主要成分的膠原纖維大量增生，肝組織HYP主要存在于膠原蛋白中，其含量可反映肝纖維化的程度。實驗結(jié)果顯示重樓皂苷能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中HYP水平，且與血清HA、LN、CⅣ、PCⅢ具有相關(guān)性。顯然，同時檢測上述指標，能更加客觀地對肝纖維化做出診斷和評價。

以上結(jié)果表明，重樓皂苷能保護肝纖維化大鼠的肝功能，減輕肝纖維化程度；且隨著肝功能的好轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)氨酶降低），肝纖維化指標也有所改善，其作用機制也在進一步研究中。

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