單側輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織PHB1和PHB2的表達及意義

雷鳳英，陳秀萍，周志強，周添標，黃韋芳，覃遠漢，蔣 玲

（1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021;2中山大學附屬第六醫(yī)院）

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是多種腎臟疾病慢性進展至終末期腎?。‥SRD）的共同病理特征［1］，其主要病理特征為腎間質(zhì)成纖維細胞增生和包括Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）和纖維連結蛋白（FN）在內(nèi)的細胞外基質(zhì)（ECM）的過度積聚［2］。PHB是一種存在于細胞內(nèi)的抗增殖蛋白，與細胞周期、凋亡與增殖、維持線粒體功能、抗腫瘤等密切相關［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，PHB與RIF發(fā)生發(fā)展密切相關［4］。本研究觀察單側輸尿管梗阻（UUO）RIF大鼠腎組織PHB1和PHB2的表達，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 動物 80只雄性6周齡Wistar大鼠，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 Wistar大鼠隨機分為假手術組和模型組，每組40只。模型組大鼠無菌條件下行左側輸尿管雙重結扎術。假手術組大鼠在同樣的條件下，僅探及腎包膜，不結扎輸尿管。兩組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)。于術后第2周末和第4周末腹腔麻醉后分別處死20只大鼠，摘除左側腎臟。分別取1/2腎臟立即用10%中性甲醛固定，用于腎臟病理學檢查;另1/2腎臟立即置于液氮冷凍保存，用于實時熒光定量RT-PCR及Western blot檢測。

1.2.2 腎組織病理學檢查 常規(guī)石蠟包埋腎臟組織，4 μm切片，行Masson染色后，光鏡下觀察腎臟的病理改變。結果采用DMR加Q550病理圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）進行半定量分析。在400倍下每張切片隨機選擇5不重疊視野，避開大血管和腎小球，將呈現(xiàn)綠色的纖維區(qū)域視為陽性目標，以陽性面積與整個視野總面積的比值作為RIF指數(shù)［5］。RIF指數(shù)（%）=（纖維化面積/腎小管間質(zhì)總面積）×100%。

1.2.3 腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA 測定采用實時熒光定量RT-PCR法。取大鼠冰凍腎臟組織100 mg，按RNA提取試劑盒提取總RNA。步驟參照試劑盒說明書。引物均由上海生物工程公司生產(chǎn)。每個樣本重復測量3次，取其平均值為樣本Ct值，用 2-△△CT法［6，7］進行 mRNA 相對表達量比較。

1.2.4 腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白檢測 采用Western blot法。取大鼠腎臟組織100 mg，在液氮中將腎組織研磨至粉末后，提取總蛋白，測定濃度?？偟鞍鬃冃院筮M行Western blot檢測，步驟參照試劑盒說明書。工作液濃度:PHB1:1∶1 000、PHB2:1∶1 500、TGF-β1:1∶2 000、Col-Ⅳ:1∶1 000、FN:1∶2 000。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，組間比較采用完全隨機設計t檢驗;采用直線相關分析進行相關分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腎臟病理改變 手術后第2周末和第4周末光鏡下假手術組大鼠腎臟無明顯病理改變。模型組大鼠手術后第2周末，腎小管和集合管呈囊狀擴張，腎皮質(zhì)區(qū)分布大量彌漫性炎性細胞，腎間質(zhì)面積增寬、腎間質(zhì)組織纖維化;第4周末腎小管結構出現(xiàn)嚴重破壞，小管間質(zhì)明顯變寬，腎小管明顯萎縮，腎小管上皮細胞（RTEC）出現(xiàn)大量壞死，大量炎性細胞和纖維組織增生。兩組RIF指數(shù)比較見表1。

表1 兩組大鼠腎組織RIF指數(shù)比較（±s，n=40）

表1 兩組大鼠腎組織RIF指數(shù)比較（±s，n=40）

注:與同組第2周末比較，*P＜0.01;與假手術組同時間點比較，△P ＜0.01

組別 RIF 指數(shù)第2周末 第4周末假手術組0.78 ±0.10 0.81 ±0.09模型組 24.48±1.33△ 40.59±1.35＊△

2.2 腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA 檢測結果見表2。

表2 兩組大鼠腎組織PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA比較（ ± s，n=40）

表2 兩組大鼠腎組織PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA比較（ ± s，n=40）

注:與同組第2周末比較，*P＜0.01;與假手術組同時間點比較，△P ＜0.01

組別 PHB1 mRNA PHB2 mRNA TGF-β1mRNA假手術組第2 周末 1.02 ±0.04 1.00 ±0.06 1.00 ±0.06第4 周末 1.01 ±0.04 0.99 ±0.06 1.01 ±0.05模型組第2周末 0.37±0.03△ 0.30 ±0.05△ 4.28±0.59△第4 周末 0.28 ±0.03＊△ 0.06 ±0.04＊△ 6.75 ±0.63＊△

2.3 腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白檢測結果 見表3。

表 3 兩組大鼠腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白比較（ ± s，n=40）

表 3 兩組大鼠腎組織 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白比較（ ± s，n=40）

注:與同組第2周末比較，*P＜0.01;與假手術組同時間點比較，△P＜0.01

組別 PHB1 PHB2 TGF-β1 Col-ⅣFN假手術組第2 周末 0.66 ±0.04 0.88 ±0.05 0.60 ±0.05 0.47 ±0.06 0.36 ±0.05第4 周末 0.67 ±0.05 0.87 ±0.06 0.61 ±0.06 0.48 ±0.07 0.37 ±0.04模型組第2周末 0.51±0.05△ 0.62 ±0.06△ 0.99±0.06△ 0.88±0.04△ 0.90±0.05△第4周末 0.28±0.06＊△ 0.43 ±0.04＊△ 1.34±0.05＊△ 1.22±0.07＊△ 1.18±0.04＊△

2.4 相關性分析結果 大鼠腎組織PHB1蛋白表達與 RIF 指數(shù)、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 均呈負相關（r分別為 -0.86、-0.87、-0.70、-0.73，P均 ＜0.05）;PHB2 蛋白表達與 RIF 指數(shù)、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 均呈負相關（r分別為 -0.73、-0.81、-0.91、-0.84，P均 ＜0.05）;PHB1蛋白表達與 PHB2蛋白表達呈正相關（r=0.78，P＜0.05）。

3 討論

UUO大鼠模型是目前研究RIF的經(jīng)典動物模型。UUO大鼠首先出現(xiàn)腎臟血流動力學改變和代謝改變，繼而出現(xiàn)腎小管損傷和RTEC凋亡和壞死，腎間質(zhì)巨噬細胞和單核細胞浸潤，腎間質(zhì)成纖維細胞和肌成纖維細胞增殖，導致包括FN和Col-Ⅳ在內(nèi)的 ECM 積聚和 RIF 發(fā)生［8，9］。TGF-β1是一種多效因子［10］，是目前公認的強致纖維化因子之一，能刺激成纖維細胞分泌Col-Ⅳ和FN，加劇纖維化，在RIF進程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，模型組術后第2周末和第4周末大鼠腎臟病理改變?yōu)槟I小管間質(zhì)變寬，腎小管萎縮，大量炎性細胞浸潤和纖維組織增生;與假手術組比較，模型組大鼠術后第2周末和第4周末腎組織RIF指數(shù)顯著增高，TGF-β1、Col-Ⅳ、FN蛋白表達均增高，與文獻報道相符［11］，提示UUO模型構建成功。

PHB是一種結構高度保守的腫瘤抑制因子，廣泛分布于真核生物、細菌、真菌、植物及哺乳動物等細胞中，能通過作用于核轉(zhuǎn)錄因子E2F使細胞周期阻滯于G1/S期，與細胞凋亡及增殖、維持線粒體功能、抗腫瘤等密切相關［3，12］。PHB 家族包括 PHB1和PHB2，分布并游離在線粒體、細胞核、細胞質(zhì)膜等部位［12］。在正常腎臟組織中可檢測到 PHB表達。Guo等［13］在不同程度腎小管間質(zhì)損傷兒童腎病的腎臟組織活檢中發(fā)現(xiàn)，PHB1在損傷的腎小管間質(zhì)中表達降低，并且其蛋白表達水平與腎小管間質(zhì)損傷程度呈負相關，同時在體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細胞株中過表達 PHB后發(fā)現(xiàn)，PHB可以抑制TGF-β1誘導成纖維細胞的增殖和表型改變。Quan等［14］應用質(zhì)譜分析高尿酸誘導體外培養(yǎng)RTEC損傷的蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)損傷的RTEC中PHB2表達顯著下調(diào)。前期研究發(fā)現(xiàn)，UUO大鼠腎臟組織PHB表達與細胞凋亡指數(shù)顯著相關［4］。

本研究結果顯示，UUO大鼠梗阻時間越長，腎臟組織PHB1和PHB2表達越低，RIF越嚴重。提示PHB1和PHB2表達顯著降低，可能參與了RIF的發(fā)生發(fā)展，但確切的作用機制有待進一步深入探討。

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