臍帶間充質干細胞移植對類風濕性關節(jié)炎患者相關炎性因子影響的探討①

王黎明 王立華 李 銘 白 雯 鐘占強 石 軍 周建軍 王倩云 吉海杰 吳明遠劉擁軍④(解放軍323醫(yī)院生物診療中心，西安 710054)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一主要累及周圍關節(jié)的自身免疫性疾病，其特征性病變?yōu)殛P節(jié)滑膜炎［1］?；颊唧w內免疫細胞過度的活化分泌了大量的炎性因子和趨化因子，在RA關節(jié)局部的炎癥發(fā)展和全身的免疫反應中起關鍵性作用。TNF-α和IL-1的抑制劑對RA的治療取得良好的療效，由此表明炎性反應參與了RA的發(fā)生和發(fā)展，然而存在著疾病復發(fā)及增加感染的幾率，且對受損的組織細胞無修復作用。近年來間充質干細胞(MSCs)基礎研究顯示，通過抑制過度活化的免疫細胞增殖、調節(jié)有關細胞因子可以緩解膠原誘導的關節(jié)炎的炎癥［2］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠通過趨化因子遷移到受損組織細胞，抑制促炎癥因子(Pro-inflammatory factor)的釋放，修復受損細胞，并且能夠誘導外周免疫耐受治療多種自身免疫性疾?。?］。但是，目前針對MSCs治療RA的機制尚無系統(tǒng)報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MSCs治療有助于RA患者臨床癥狀的改善且安全性好［4］。因此為了進一步研究MSCs治療RA的作用機制，現(xiàn)將94例RA患者應用臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)治療前、后免疫細胞分泌的相關炎性因子變化進行探討，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 自2011年4月至2012年12月在我科住院應用UC-MSC治療的94例RA患者，男10例，女84例，年齡17～70歲，病程1.5～40年;94例患者符合1987年美國風濕病學會提出的RA分類標準。94例接受了1次UC-MSCs治療，其中60例接受了2次UC-MSCs治療。全部患者長期不規(guī)律使用非甾體抗炎藥(NSAIDs)、改善病情抗風濕藥(DMARDs)及糖皮質激素、中藥等藥物治療，病情控制不佳。94例患者均有不同程度的多關節(jié)疼痛，疼痛關節(jié)數(shù)＞3個，晨僵＞1 h，伴有多個指間和指掌關節(jié)腫脹，22例患者伴有指關節(jié)畸形，呈尺偏和/或“鵝頸”樣改變。22例患者ESR在20～40 mm/h之間，34例在40～80 mm/h之間，32例ESR＞80 mm/h，6例血沉正常;22例患者CRP在10～40 mg/L之間，39例在40～80 mg/L之間;23例＞80 mg/L，10例CRP正常;86例患者類風濕因子陽性，檢測ANA譜中14例患者SSA-52抗體陽性(+～+++)、23例患者SSA-60抗體陽性(+～+++)，5例SS-B抗體陽性(+～+++);抗CCP抗體陽性88例，X線Larsen評分Ⅰ級34例，Ⅱ級37例，Ⅲ-Ⅳ級22例，正常1例。4例患者胸片提示有不同程度的肺間質增生。所有患者細胞治療前經(jīng)院倫理委員會批準，患者知情同意并簽字。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢測 患者外周血中細胞因子水平檢測:用促凝管收集RA患者外周血，靜置30 min后，3 500 r/min，5 min離心，取出血清后分裝于0.6 ml EP管中，每管200 μl，－80℃保存以備檢測。用Milliplex多因子檢測試劑盒(Human Cytokine/Chemokine Panel I，TGF1 single plex kit)檢測血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-15、IL-17、RANTES、TGF-β、TNF-β、lymphotactin 的 13種因子含量，多功能流式點陣儀Luminex 200分析檢測。以上項目均由和澤科技生物有限公司實驗室提供。CRP、自身抗體水平、抗CCP抗體、血沉、肝功、腎功、血脂檢測在我院實驗室檢測。

1.2.2 臍帶間充質干細胞采集及制備 臍帶間充質干細胞由天津協(xié)和國家干細胞臍血庫提供，制備過程［5］:采集新生兒臍帶，將臍帶剪碎至約1 mm×1mm×1 mm，經(jīng)0.1%膠原酶和0.125%的胰酶37℃消化30 min，先后用100目及200目濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織。過濾后的細胞按1×106/cm2接種于塑料培養(yǎng)瓶，用含 DMEM-LG/F12(Sigma，USA)，5%FCS(Gibco BRL，USA)的培養(yǎng)基，置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4～5 d后換液，棄非貼壁細胞，以后每3～4 d半量換液。待細胞80%融合，0.25%胰酶(Sigma，USA)消化，按1×104/cm2傳代。貼壁細胞常規(guī)消化后，以FITC標記的CD105(SH2)、CD44抗體及其相應同型對照標記細胞，流式細胞儀(FACA Calibur型，USA)檢測。獲得(1.0～5.6)×107的臍帶間充質干細胞，流式細胞儀檢測陽性率為80%。

1.2.3 治療方法 94例患者均直接將細胞數(shù)為4×107的UC-MSC40ml靜脈輸注，其中57例患者行2次細胞治療。

1.3 療效評估標準

1.3.1 臨床療效評估 28個關節(jié)的疾病活動度評分(DAS28)［6］DAS28≤2.6分提示病情處于緩解期;2.6～3.2分之間提示病情處于低活動度;3.2～5.1分之間提示病情為中活動度;＞5.1分提示病情為高活動度;健康評定量表(HAQ)［7］。

1.3.2 實驗室療效評估 CRP、ESR、相關炎性因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-15、IL-17、RANTES、TGF-β)。

1.4 隨訪觀察 隨訪時間:按細胞治療前及治療后1周、3個月、6個月。

1.5 安全性評估 每次隨訪記錄患者的不良反應，定期檢查肝腎功能、心電圖、X線胸片、血壓等指標以觀察其不良反應及其轉歸情況。不適反應分級為:0.無不適;1.輕度不適，未影響日常生活;2.中度不適，影響日常生活和工作;3.中度不適，明顯影響生活，臥床休息;4.重度不適，危及生命。

1.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析均采用SPSS17.0軟件程序進行t-配對檢驗分析，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2 結果

2.1 有效性評估 94例患者，隨訪1周、3個月(第1次細胞治療后，觀察到3個月)、6個月(94例中53例第1次細胞治療后的3個月進行第2次細胞治療，觀察到6個月)，全部患者在飲食、睡眠、體力、疲勞等方面均有明顯改善;按美國風濕病協(xié)會(ARA)制定的類風濕性關節(jié)炎療效評估標準，治療后3個月77.6%患者滿足ARA20標準，多關節(jié)疼痛、腫脹、壓痛明顯緩解，疼痛、腫脹的關節(jié)數(shù)減少，關節(jié)活動度增加，晨僵＜1 h;73例患者DAS28＜3.2;18例患者DAS28在3.2～5.1分之間，3例DAS28 ＞5.1分;按DAS28評分標準、HAQ評分標準(參見圖1)，3個月、6個月較治療前逐漸下降，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，2次治療較1次治療繼續(xù)下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);ESR、CRP(參見圖2)在治療后1周顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，3個月、6個月較治療前也有下降，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。復查患者手X線片無明顯變化。

2.2 相關因子檢測 IL-6、TNF-α治療后1周、3個月、6個月進行檢測，均呈下降水平，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);IL-8治療后1周出現(xiàn)升高現(xiàn)象，隨之在3個月時較治療前下降、在6個月時明顯下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 患者治療前、后3個月、6個月DAS28、HAQ評分圖Fig.1 HAQ and DAS28 of RA patients tested in different times

2.3 安全性評估 不適反應分級為:0.無不適;1.輕度不適，未影響日常生活;2.中度不適，影響日常生活和工作;3.中度不適，明顯影響生活，臥床休息;4.重度不適，危及生命。94例患者安全性評估與我們前期研究相同，無患者出現(xiàn)各級反應;94例患者在治療前及隨訪的3、6個月進行了血常規(guī)、肝腎功能、血脂檢測均在正常范圍內，未見異常［4］。

圖2 患者治療前、后1周、3個月、6個月 CRP、ESR變化圖Fig.2 CRP and ESR of RA patients tested in different times

圖3 患者治療前、后1周、3個月、6個月IL-6、TNF-α變化圖Fig.3 IL-6 and TNF-α of RA patients tested in different times

圖4 患者治療前、后1周、3個月、6個月IL-8變化圖Fig.4 IL-8 of RA patients tested in different times

3 討論

RA存在著促炎細胞因子和抑炎細胞因子的失衡，從而導致自身免疫疾病的產生、慢性炎癥及關節(jié)損害。T輔助細胞(Th)在RA中主要是通過分泌細胞因子起作用，但各亞型所分泌的細胞因子不同，他們在復雜的調控網(wǎng)絡中起的作用不同，有研究顯示RA患者的關節(jié)炎癥反應與CD4+T細胞的大量浸潤有關，Th1細胞所分泌的細胞因子如IL-1、TNF-α、IFN-α等。TNF-α起促炎作用，參與RA發(fā)生和發(fā)展的過程。TNF-α誘導內皮細胞表達黏附分子(如ICAM-1)，促進白細胞和血管內皮的黏附滲透，導致局部炎癥，同時增加滑膜及內皮細胞成纖維細胞生長因子的釋放而促進了血管翳的形成，另外還可促使滑膜細胞、巨噬細胞、纖維母細胞和軟骨細胞產生IL-1、IL-8及其本身來加重組織損傷。IL-6和趨化因子如IL-8對誘發(fā)炎癥反應起著重要作用［8］。IL-6是RA關節(jié)炎癥中的主要炎性介質，在RA的發(fā)病機制中起著促炎作用，也參與RA發(fā)生、發(fā)展的過程。在RA中IL-6的致病作用是直接刺激滑膜母細胞和軟骨細胞產生前列腺環(huán)素E2和膠原酶，增強了IL-1、TNF-α的效應，并誘導其他細胞因子IL-1、IL-2、TNF-α 產生并發(fā)揮致病作用［9］。我們的研究結果證實了RA患者體內TNF-α、IL-6明顯增高，說明RA患者存在著慢性炎癥反應。傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥物(NSADs)和慢作用抗風濕藥(SAARDs)由于諸多因素并不能完全緩解病情，使RA不斷進展，甚至致殘。近年來隨著生物細胞技術的發(fā)展，許多研究證實MSCs在體內外可以分化為成骨、軟骨、脂肪、腱、肌肉等細胞［10］，可能參與受損組織的再生修復;關節(jié)病變可以促進MSCs向病變滑膜聚集，從而修復損傷的關節(jié)組織［11］。MSCs加入到有絲分裂原刺激的外周血淋巴細胞培養(yǎng)體系中，均能明顯抑制T淋巴細胞的增殖活化，同時MSCs具有趨化作用，可以阻止炎性介質的釋放，減輕炎癥反應，減輕組織損傷，有利于阻止病情進展［12］。然而，RA患者自身的MSCs不能像正常人的MSCs一樣具有較高的克隆和增殖能力［13］，因此，我們可以通過應用異源性MSCs來治療以上患者，達到臨床癥狀改善的目的。常見MSCs有兩種來源:骨髓和臍帶，而后者更易獲得，同時具有分化能力高、免疫原性低等優(yōu)勢［14］，本文的研究選擇了UC-MSCs。通過我們對本組RA患者輸注UC-MSCs前后相關炎性因子的檢測結果顯示，IL-6、TNF-α治療后 1周、3個月、6個月均呈下降水平(P＜0.05);有趣的是IL-8治療后1周出現(xiàn)升高現(xiàn)象，隨之在3個月時較治療前下降、在6個月時明顯下降(P＜0.05)，這是否說明IL-8參與對炎性因子的趨化(IL-6、TNF-α)作用還需進一步證實。同時經(jīng)過細胞治療的RA患者ESR、CRP指標的下降(P＜0.05)，及 DAS28、HAQ評分的降低(P＜0.05)、治療后3個月77.6%患者滿足 ARA20標準，進一步證明了炎性因子下調與RA患者臨床指標及癥狀的緩解直接相關。通過對53例2次輸注U-MSCs患者6個月炎性因子、臨床指標的檢測，仍保持在一個穩(wěn)定水平，并有繼續(xù)下降的趨勢。94例患者其他炎性因子(IL-17、IL-4、IL-10等)也有一些變化，但未找到規(guī)律性的變化，仍需進一步觀察探討。

本研究表明，對傳統(tǒng)藥物治療反應欠佳的活動性類風濕性關節(jié)炎患者而言，hUC-MSCs治療可以長期、安全有效地降低疾病活動性，并且無毒副作用。UC-MSCs可能通過降低外周血炎性因子及趨化因子的濃度來改善臨床癥狀，提示hUC-MSCs有抗炎、免疫調節(jié)作用。RA患者的病損關節(jié)中，TNF-α、IL-1和IL-6［15-18］水平升高，提示其可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展［17］。眾所周知，滑膜細胞分泌的細胞因子增多是類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制之一［19］。而MSCs可以表達多種炎性因子的受體，從而可以結合炎性因子來有效降低RA患者的炎癥反應［14］。UCMSCs治療后，患者血清TNF-α、IL-6和CRP水平顯著性降低，表明抗炎作用或許是UC-MSCs治療類風濕性關節(jié)炎的機制之一。

綜上所述，UC-MSCs可以安全有效地治療活動性類風濕性關節(jié)炎，顯著改善了所有患者的臨床癥狀，提高了生活質量，阻止病情進展。首次治療后療效可以維持3個月以上，二次治療可以進一步鞏固首次治療效果。UC-MSCs可能成為臨床治療類風濕性關節(jié)炎的新選擇。

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