中國牛種布魯氏菌疫苗株A19SNP位點(diǎn)的研究

譚鵬飛，南文龍，彭大新，毛開榮，陳義平*

(1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室，山東青島266032;2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征的人畜共患傳染病，嚴(yán)重威脅人和多種動(dòng)物健康［1］。弱毒疫苗免疫是布病防控的重要手段，但其使用往往會(huì)干擾布病診斷和監(jiān)測。

布魯氏菌A19菌株于1923年由美國自牛奶中分離，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自然傳代減毒后，成為一株毒力穩(wěn)定的弱毒菌株，是我國目前在用的布魯氏菌疫苗株之一［1］。疫苗株S19是在A19基礎(chǔ)上篩選出的赤蘚糖醇敏感株。S19基因組較A19存在Ery基因缺失，OIE將這一特點(diǎn)作為S19的鑒別診斷依據(jù)，但該方法并不適用于A19。目前，A19鑒別檢測研究尚少，本研究擬篩選、驗(yàn)證A19基因組的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，為疫苗株A19與野生菌株的鑒別提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 23種布魯氏菌見表1。布魯氏菌常見種及生物型標(biāo)準(zhǔn)株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存，布魯氏菌疫苗株 A19、S19、M5-90、S2、104M 由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室保存。

表1 使用的布魯氏菌株及登錄號(hào)

1.1.2 主要試劑 dNTP、DL2000 Marker、EX Taq?Hot Start DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K購自Sigma公司;胰蛋白胨培養(yǎng)基購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及基因組DNA的提取 實(shí)驗(yàn)菌株復(fù)蘇和培養(yǎng)參照中國獸醫(yī)菌種目錄中方法，細(xì)菌基因組DNA提取采用蛋白酶K法按常規(guī)步驟［2］進(jìn)行。

1.2.2 SNP位點(diǎn)的分析篩選 從GenBank中下載與布魯氏菌疫苗株A19同源的S19株全基因組序列(GenBank登錄號(hào):NC_010742.1、NC_010740.1)，利用生物信息學(xué)軟件BLAST和DNAstar，將S19基因組逐段與 GenBank中 B.melitensis M28、B.suis S1330、B.pinnipedialisB2/94、B.microti CCM 4915、B.canis ATCC 23365、B.ovis ATCC 25840 等16株布魯氏菌基因組序列進(jìn)行比較，分析篩選S19全基因組序列SNP位點(diǎn)。

1.2.3 SNP位點(diǎn)的測序鑒定 以篩選出的SNP位點(diǎn)為依據(jù)，對含有SNP位點(diǎn)的相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物(表2)，以A19基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序鑒定A19基因組SNP位點(diǎn)處的核苷酸序列。

反應(yīng)體系 25 μL:10 ×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2.0 μL、引物 (20 μmol/L)各 1.0 μL、EX Taq?Hot Start(5 U/μL)0.3 μL、Template 2.0 μL、ddH2O 9.7 μL;反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃ 40 s，52～60℃(退火溫度根據(jù)引物Tm值確定)40 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 延伸6 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.2.4 SNP位點(diǎn)的選擇驗(yàn)證 選擇2～3個(gè)經(jīng)鑒定正確的A19 SNP位點(diǎn)，以布魯氏菌常見種及生物型的標(biāo)準(zhǔn)株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布魯氏菌的基因組DNA模板(表1，編號(hào)1-21)，按1.2.3方法，對相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序。分析上述21株布魯氏菌基因組在所選SNP位點(diǎn)處的核苷酸序列，驗(yàn)證所選SNP位點(diǎn)的A19特異性。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點(diǎn)的分析篩選結(jié)果 將S19全基因組與GenBank中其他布魯氏菌全基因組序列進(jìn)行比較，分析獲得29個(gè)SNP位點(diǎn)，堿基位置和變化見表3。

2.2 SNP位點(diǎn)測序鑒定結(jié)果 以A19基因組DNA為模板，對2.1中S19的29個(gè)SNP相關(guān)基因PCR擴(kuò)增，均獲得了與預(yù)期相符的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，A19這29個(gè)基因的序列與S19同源性為100%，說明A19基因組存在與S19基因組相同的29個(gè)SNP位點(diǎn)。

表2 SNP相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增引物

表3 S19基因組SNP位點(diǎn)所在基因堿基位置和變化

圖1 SNP相關(guān)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果 結(jié)果顯示，僅A19與S19 基因組存在 ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503的突變，而布魯氏菌常見種及生物型的標(biāo)準(zhǔn)株及疫苗株基因組相應(yīng)位置均沒有變化，說明上述3個(gè)SNP位點(diǎn)為A19(或S19)特異。

3 討論

3.1 疫苗株A19的鑒別研究 布魯氏菌疫苗的鑒別主要包括血清抗體和病原兩方面。A19疫苗株為光滑型菌株，其LPS含有O-側(cè)鏈，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，對牛有一定的保護(hù)力，但也使常規(guī)血清學(xué)檢測方法無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染［1］。在A19病原鑒別方面，谷文喜等［3］發(fā)現(xiàn)VirB8基因上108位堿基的G-T突變，可作為疫苗株A19和544A與野生菌株的鑒別依據(jù)之一;吳冬玲等［4］利用A19赤蘚醇代謝基因序列差異，區(qū)分了我國疫苗株A19和牛I型強(qiáng)毒株2308，但是上述兩種方法還未能明確區(qū)分出疫苗株A19與野生菌株。鐘旗等［5］建立了聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法，首先以AMOS-PCR方法區(qū)分牛種布魯氏菌株，再以B1-PCR方法鑒定牛種生物I型菌株，然后以Ery-PCR方法對牛種生物I型菌株和A19株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過SSCP電泳根據(jù)條帶數(shù)目和大小的差異，區(qū)分了牛種生物I型菌株和A19株，從而對疫苗株A19與野生菌株進(jìn)行了鑒別。目前，我國布病防控工作中，尚缺少直接、快速的疫苗株A19分子鑒別檢測方法。

3.2 疫苗株A19的SNP位點(diǎn) SNP指單個(gè)核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形態(tài)。近年，SNP位點(diǎn)廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性基因、細(xì)菌分種分型、病毒分型等鑒別檢測中［6-8］。Gopaul等［9］利用S19基因組ClpX、LysR兩個(gè)基因SNP位點(diǎn)的差異，通過熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了S19的分子鑒別檢測。當(dāng)前，我國尚未推廣弱毒疫苗S19株，A19與S19基因組具有高度的同源性，S19基因組特異的SNP位點(diǎn)，若在A19含有相同SNP位點(diǎn)，同樣適用于我國A19株的鑒別。

本研究以S19基因組為依據(jù)，經(jīng)與GenBank中公布的布魯氏菌全基因組比對，篩選了29個(gè)SNP位點(diǎn)，并證實(shí)A19基因組存在相同的SNP位點(diǎn)。選取ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503等3個(gè)SNP位點(diǎn)，通過與布魯氏菌常見種及生物型的標(biāo)準(zhǔn)參考株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布魯氏菌的基因組SNP位點(diǎn)處的核苷酸序列比較，證明這3個(gè)SNP位點(diǎn)僅存在于A19(或S19)基因組上，而其他種、生物型布魯氏菌或疫苗株上均沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變，說明這3個(gè)SNP位點(diǎn)可用于我國布魯氏菌疫苗株A19與野生菌株的鑒別。同時(shí)，也說明Gopaul等［9］建立的S19鑒別檢測熒光定量PCR方法，目前同樣適用于我國布魯氏菌疫苗株A19的鑒別。

此外，筆者還對近年采集于我國布魯氏菌非免疫地區(qū)的血清及奶樣中提取的核酸樣品進(jìn)行了檢測，其中經(jīng)B4/B5-PCR方法［10］檢測陽性的樣品，經(jīng)本方法檢測均未發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)基因SNP位點(diǎn)處存在突變，即樣品為非疫苗株A19的野生菌株感染。

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