質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類抗生素耐藥機制研究進展

王 梓，孔令聰，高 鐸，劉樹明，馬紅霞，2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118)

氟喹諾酮類藥物作為廣譜抗菌藥自1962年投入臨床使用至今已有50余年歷史，已成為臨床中最為常用的抗生素之一。氟喹諾酮類藥物屬于濃度依賴型抗生素，致病菌如果長期處于其亞抑菌濃度時極易產(chǎn)生突變成為耐藥菌［1－3］。作為氟喹諾酮類藥物的主要耐藥機制之一，質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥(Plasmid－mediated quinolone resistance，PMQR)具有傳播速度快、基因亞型較多等特點，且其攜帶的耐藥基因可對細菌染色體上氟喹諾酮類藥物耐藥基因進行靶位修飾，使靶位突變頻率增加［4－5］，嚴重影響氟喹諾酮類藥物的使用壽命。故探索質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥機制對于控制耐藥基因的快速傳播，減少耐藥菌的危害具有重要意義。

1 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥基因的發(fā)現(xiàn)

現(xiàn)有研究表明，質(zhì)粒攜帶的氟喹諾酮類藥物耐藥基因主要有3種，分別為包含有多種亞型的qnr基因、介導(dǎo)主動外排的基因、發(fā)生點突變的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。其中，Martínez－Martínez等在研究肺炎克雷伯菌天然攜帶的pMG252質(zhì)粒時，首次發(fā)現(xiàn)了五肽重復(fù)序列qnr基因［6］，隨后陸續(xù)報道了多種qnr基因亞型［7－9］。此后，在對 qnr基因的作用機制進行研究時發(fā)現(xiàn)，qnr基因既能介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥，還可以通過增加gyrA、parC等靶位基因的突變頻率，使細菌耐藥能力增強［10］。各qnr基因亞型概況如表1所示。隨后，Haru Kato等［11］在日本確證了由質(zhì)粒介導(dǎo)的外排基因QepA，在該試驗中發(fā)現(xiàn)，QepA基因能夠介導(dǎo)細菌對諾氟沙星的外排作用，且其外排可以被外排泵抑制劑CCCP(carbony cyanide m－chlorophenyl－h(huán)ydrazone)抑制，為質(zhì)子依賴型外排泵。由此推測，QepA基因所介導(dǎo)的外排作用可能是質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥的重要途徑之一。G.A.Jacoby等在研究中又發(fā)現(xiàn)了另一種PMQR基因aac(6')－Ib－cr，該基因由氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生Trp102Arg和Asp179Tyr點突變獲得，其可介導(dǎo)大腸桿菌對環(huán)丙沙星的抗性［12］，該基因自發(fā)現(xiàn)以來在氟喹諾酮耐藥菌株中傳播迅速，在三類PMQR基因中檢出率較高［13－15］。

表1 qnr基因各亞型概況

2 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥基因的分布

現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種PMQR基因常共存于同一耐藥質(zhì)粒中。Kees Veldman等在歐洲13個國家分離出的沙門氏菌和大腸桿菌中分別檢測出 qnrA1、qnrB、qnrD、aac(6’)－Ib－cr基因，其中 qnrD基因為在歐洲出現(xiàn)的首次報道［16］;Ya－Hong Liu等在廣東省分離的大腸桿菌中分別檢測出 qnrB、qnrS、aac(6’)－ Ib－cr、QepA 等基因［17］;Patricia Andres等在南美洲分離的百余株腸桿菌中也擴增出 qnrB、qnrS、aac(6’)－Ib－cr等氟喹諾酮耐藥基因［18］。由于單獨的PMQR基因通常只介導(dǎo)低水平耐藥，故耐藥菌常通過多種耐藥基因的共同作用以形成高水平耐藥性。近年來，由于動物運輸、耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移等因素，PMQR基因已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，伴隨著PMQR基因突變的不斷發(fā)生，未來將會有更多的PMQR基因耐藥亞型不斷出現(xiàn)。同時，攜帶氟喹諾酮類藥物耐藥基因的質(zhì)粒也可能攜帶其他多種耐藥基因，報道最多的為與廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因共存。通過多種類耐藥基因在同一質(zhì)粒上的整合即可形成多重耐藥質(zhì)粒，而且多重耐藥質(zhì)粒的分布范圍也在逐步擴大，在沙門氏菌、克雷伯菌、變形桿菌中均發(fā)現(xiàn)多重耐藥質(zhì)粒的存在［19－20］，但質(zhì)粒攜帶的多種耐藥基因的表達水平是否可以相互影響，還需進一步研究驗證。

3 質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制

3.1 PMQR基因的傳播機制 攜帶PMQR基因的耐藥質(zhì)?？焖賯鞑ナ悄壳胺Z酮類藥物耐藥性增強的重要因素之一。質(zhì)粒上攜帶的PMQR基因可以直接通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移實現(xiàn)基因的相互傳遞，也可利用質(zhì)粒中整合子、轉(zhuǎn)座子的傳遞實現(xiàn)PMQR基因的快速傳播。Humberto Barrios等將攜帶β－內(nèi)酰胺耐藥基因(CTX－M－15)和多個氟喹諾酮耐藥基因(qnrA1、qnrB2、aac(6’)－Ib－cr)的質(zhì)粒在不同溫度下進行接合轉(zhuǎn)移實驗:結(jié)果在受體菌中發(fā)現(xiàn)了兩個不同的質(zhì)粒，其中大小為300 kb的質(zhì)粒pSZ300中攜帶了 CTX －M －15、qnrA1、aac(6’)－Ib－cr基因，并產(chǎn)生氟喹諾酮類藥物抗性;而大小為50 kb的質(zhì)粒pSZ50中僅發(fā)現(xiàn)有qnrA1基因，測序結(jié)果顯示 pSZ50包含于質(zhì)粒 pSZ300中［21］。此試驗證明，質(zhì)粒在水平傳播過程中能發(fā)生重組，從而導(dǎo)致耐藥質(zhì)粒多樣化。Be'la Kocsis等首次發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒ST147中qnrS1可與窄譜β－內(nèi)酰胺酶LAP－2基因共存，并進一步通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗獲得了一個97 kb質(zhì)粒，其同時攜帶有供體菌上的上述兩種耐藥基因，進而使受體菌對頭孢他啶、環(huán)丙沙星等藥物的MIC值均提高了2倍以上［22］。如果細菌的染色體上存在耐藥基因，則質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR機制可促使細菌產(chǎn)生更高水平的耐藥，給臨床治療帶來困難。通過類似多藥耐藥轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的橫向傳播，將會使不同菌屬細菌間形成復(fù)雜的高水平多重耐藥機制。而設(shè)法限制耐藥質(zhì)粒的快速傳播，將成為減緩細菌對氟喹諾酮類抗菌藥的主要途徑之一。

3.2 PMQR基因表達的調(diào)控機制 目前有關(guān)QepA、aac(6’)－Ib－cr基因的研究多集中于流行病學(xué)調(diào)查中耐藥基因的種類檢測，關(guān)于影響PMQR基因調(diào)節(jié)和表達的報道還較少。最近的研究證實，細菌的SOS反應(yīng)是調(diào)節(jié)qnr基因表達量的重要因素之一。SOS反應(yīng)是細菌在DNA受到持續(xù)損傷壓力下產(chǎn)生的一種自救反應(yīng)，可以由LexA、RecA等基因調(diào)控，能夠增加細菌耐藥基因的突變頻率。近年來已有學(xué)者相繼報道了多種qnr基因可以在細菌發(fā)生SOS反應(yīng)時發(fā)生表達量的改變。其中，David C.Hooper等通過改變溫度增加細菌的生存壓力使其產(chǎn)生SOS反應(yīng)的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試菌的qnrB基因表達量增加，進而對環(huán)丙沙星的耐受能力明顯增強，對qnrB基因進一步基因環(huán)境研究表明，qnrB基因的上游序列中存在的LexA基因可對細菌DNA的持續(xù)損傷壓力產(chǎn)生應(yīng)答，從而引發(fā)細菌的SOS反應(yīng)提高qnrB的表達量［23］。隨后，A.Briales等發(fā)現(xiàn)qnrD基因以及一個新型染色體攜帶的Smaqnr基因都擁有相似的LexA結(jié)構(gòu)，可以在不同濃度的環(huán)丙沙星、莫西沙星等藥物作用下將上述qnr基因表達量提高 1.5 ～16 倍［23－24］。上述實驗結(jié)果證明，通過溫度改變、藥物作用等方式增加細菌生存壓力時，可以選擇性的誘發(fā)細菌的SOS反應(yīng)，繼而使含有LexA結(jié)構(gòu)的qnr基因發(fā)生表達量的改變，使細菌產(chǎn)生更強的耐藥性。目前，有關(guān)三種PMQR基因表達機制的深入探索還有待進一步的研究。

3.3 PMQR基因的作用機制 在三種PMQR基因中，QepA的作用機制主要通過主動外排系統(tǒng)減少藥物在細菌菌體內(nèi)的聚集，其外排泵結(jié)構(gòu)與MFS外排泵超家族極為相似，為質(zhì)子依賴型外排泵，細菌可依靠其外排作用提高對諾氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物的MIC值2倍以上，并能在其他耐藥基因共同作用下使細菌產(chǎn)生更強耐藥性［11］。aac(6’)－Ib－cr的作用機制為，當 aac(6’)－Ib基因的102位色氨酸突變?yōu)榻M氨酸及179位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼峁餐l(fā)生時，即可將環(huán)丙沙星與細菌結(jié)合位點乙?；瑥亩蛊涫毦囊种谱饔?。細菌存在aac(6’)－Ib－cr基因的同時，還可增加染色體上相關(guān)耐藥基因的突變頻率，從而增強細菌的耐藥性。而當QepA基因與aac(6’)－Ib－cr基因共存與耐藥質(zhì)粒上時，可使細菌對環(huán)丙沙星的耐藥性較qnrA基因單獨作用時提高4倍以上，達到藥物敏感性折點［25］。而目前有關(guān)qnr基因作用機制尚未完全闡明，其機制的探索主要參考其他五肽重復(fù)蛋白(pentapeptide repeat－containing proteins)，如染色體上同樣可以介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥的McbG和MfpA蛋白。編碼McbG和MfpA的基因與qnr基因具有19.6%和18.9%的同源性，其主要耐藥機制是通過保護DNA促旋酶和抑制藥物對DNA的超螺旋作用［26－27］。近年來新發(fā)現(xiàn)了兩種新型染色體攜帶的 qnr－like基因，即 EfsQnr和 Smaqnr。其作用機制與MfpA較相似，可以抑制ATP依賴型DNA超螺旋，從而產(chǎn)生對氟喹諾酮類藥物的耐藥性;而Smaqnr基因與qnrB1基因具有高達80%的同源性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的同源性最高的qnr－like基因［28－29］。通過對這些染色體上攜帶的qnr－like基因作用機制的深入研究，可以逐步探索質(zhì)粒攜帶qnr基因的作用機制及遺傳環(huán)境，為質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制的進一步闡明及在根本上限制細菌的耐藥性奠定基礎(chǔ)。

4 展望

隨著質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥機制研究的不斷深入，人們對細菌氟喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生及傳播有了更全面的認識。但同時，細菌的耐藥性也日趨復(fù)雜，近期研究顯示，質(zhì)粒介導(dǎo)的 aac(6’)－Ib－cr基因在染色體中也被發(fā)現(xiàn)［25］，這說明細菌正通過改變自身的耐藥途徑來增加人們控制其耐藥性的難度。在未來的研究中，可能還會有更多耐藥基因在染色體和質(zhì)粒中相互整合，形成復(fù)雜的耐藥環(huán)境。因此，在規(guī)范臨床合理用藥的同時，利用現(xiàn)有細菌耐藥機制研究的深層成果，通過基因敲除、反義RNA等生物學(xué)方法控制耐藥質(zhì)粒的快速傳播、抑制耐藥基因的表達，將是未來控制細菌耐藥性的有效途徑之一。同時，對于細菌耐藥機制的研究也應(yīng)繼續(xù)進行，闡明耐藥基因在染色體與質(zhì)粒中的整合途徑及影響方式等未知耐藥機制。相信經(jīng)過廣大科研工作者的不斷努力，一定能夠有效控制細菌耐藥性，為人類的生命安全提供保障。

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