外排體促進(jìn)骨再生的研究進(jìn)展

陳文杰，殷嫦嫦，虞蕾琳，李忠友，殷 明

(1.南昌大學(xué) 研究生院醫(yī)學(xué)部, 江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨科, 江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院 九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 九江 332000；4.九江市中醫(yī)院, 江西 九江 332000)

骨損傷尤其是骨折是臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病，由于缺乏骨再生，即使是輕微骨折也會(huì)導(dǎo)致患者的預(yù)后不佳。據(jù)報(bào)道，由于骨再生不足，2%～10%的骨折會(huì)發(fā)展成骨不連[1]。因此如何加快骨折愈合、促進(jìn)骨再生是目前迫切需要解決的問(wèn)題。然而，現(xiàn)今的治療“金標(biāo)準(zhǔn)”：自體骨和同種異體骨移植可能會(huì)導(dǎo)致很多并發(fā)癥。因此，當(dāng)務(wù)之急是找到一種有強(qiáng)大成骨能力且并發(fā)癥發(fā)生率低的治療方法。外排體的成骨能力強(qiáng)、安全性好，這為骨再生提供了一種新的治療方法。

1 骨再生中各類(lèi)細(xì)胞的分工合作

骨是高度血管化的組織，依賴血管和骨細(xì)胞之間的密切連接來(lái)保持骨骼的完整性，在骨骼發(fā)育和骨折修復(fù)中，血管生發(fā)十分重要。此外破骨細(xì)胞溶解吸收骨，而骨細(xì)胞合成新骨; 骨再生是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量和活動(dòng)動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果，骨重建位點(diǎn)釋放細(xì)胞因子，募集破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞繼續(xù)分化，基質(zhì)成熟并礦化，骨表面恢復(fù)后，成熟的成骨細(xì)胞凋亡或最終分化為成骨細(xì)胞，其嵌于鈣化基質(zhì)中響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力[2]。骨再生分為兩種:膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨[3]。膜內(nèi)成骨是直接通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化導(dǎo)致骨骼鈣化，而軟骨內(nèi)成骨比較復(fù)雜，通過(guò)軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼的生長(zhǎng)和形成，軟骨細(xì)胞中心的軟骨停止增殖,開(kāi)始擴(kuò)大，合成和釋放X型膠原蛋白質(zhì),肥厚性軟骨細(xì)胞進(jìn)行礦化、誘導(dǎo)血管滲透、成骨分化及遷移。除了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)骨再生也有重要的作用。聚集的內(nèi)皮細(xì)胞能分泌VEGF并且指導(dǎo)軟骨細(xì)胞消化周?chē)募?xì)胞基質(zhì),最終軟骨細(xì)胞凋亡、血管和骨母細(xì)胞滲透入細(xì)胞基質(zhì)共同促進(jìn)骨的生長(zhǎng)[4]。此外，骨再生和血管再生是密切相關(guān)的，血管再生受損會(huì)導(dǎo)致骨再生受損。血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch基因敲除后不僅血管生成減少了，骨密度和骨質(zhì)量也會(huì)減少[5]。之前對(duì)骨再生的研究主要是針對(duì)細(xì)胞功能，而細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞很少有人涉及。但是，細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞對(duì)骨再生影響很大。因此，如果能發(fā)現(xiàn)一種增加成骨細(xì)胞形成和加強(qiáng)細(xì)胞間物質(zhì)傳遞的治療方法，在未來(lái)的臨床治療中將會(huì)起到重要作用。外排體，有上述兩種作用，這使之成為研究的熱點(diǎn)。

2 外排體的特性

外排體，來(lái)源于內(nèi)吞作用的一種小囊泡，是一種由真核細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的、直徑約30～100 nm的膜性小囊泡，含有其來(lái)源細(xì)胞的胞膜、蛋白質(zhì)、mRNA和微小RNA(miRNA)等成分，通過(guò)與鄰近的細(xì)胞膜融合進(jìn)而將一個(gè)細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)傳遞到另一個(gè)細(xì)胞，從而在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞[6]。外排體表面蛋白質(zhì)TSG101、CD9、CD63、CD81和CD82實(shí)現(xiàn)了囊泡與靶細(xì)胞膜的連接[7]。外排體傳遞的物質(zhì)很廣泛，外排體分泌的蛋白質(zhì)和RNA對(duì)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞功能來(lái)說(shuō)是最重要的,外排體中的miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞定向分化和活性中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[8]。光譜法數(shù)據(jù)表明外排體中有超過(guò)4 000種蛋白質(zhì)，盡管不同來(lái)源的外排體蛋白質(zhì)的功能不盡相同，但有些蛋白質(zhì)是所有外排體所共有的。這些共有的蛋白質(zhì)是細(xì)胞間物質(zhì)傳遞相關(guān)蛋白質(zhì)，如HSP70和HSP90是所有外排體蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白質(zhì)[9]。

3 外排體促進(jìn)各種器官和組織的再生

外排體的再生作用已經(jīng)在其他組織和器官中被證實(shí)了。經(jīng)過(guò)外排體治療的器官功能明顯改善：在心肌梗死小鼠模型中，經(jīng)過(guò)外排體療法的小鼠心室重構(gòu)和左心室射血分?jǐn)?shù)可見(jiàn)明顯的改善[10]；外排體能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而促進(jìn)其再生，在肺動(dòng)脈高壓的小鼠模型中，外排體療法抑制了病情的進(jìn)展并且通過(guò)細(xì)胞保護(hù)作用避免了肺損傷；外排體還能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和皮膚再生[11]。外排體不僅能減少細(xì)胞的凋亡還能延長(zhǎng)細(xì)胞的生存周期。這些研究為外排體療法奠定了基礎(chǔ)并為探究其在骨再生中的作用提供了參考。

4 外排體調(diào)節(jié)骨再生

4.1 外排體調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

外排體直接調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系[12]。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體在成骨分化過(guò)程中9種miRNAs (let- 7a、miR- 199b、miR- 218、miR- 148a、miR- 135b、miR- 203、miR- 219、miR- 299- 5p和miR- 302b)的表達(dá)上調(diào)，5種miRNAs(miR- 221、miR- 155、miR- 885- 5p、miR- 181a和miR- 320c)的表達(dá)下調(diào)，所有這些miRNA在成骨分化中均起到一定的作用[13]。同時(shí)，成骨細(xì)胞也能分泌外排體，對(duì)骨生長(zhǎng)起到正反饋?zhàn)饔?，成骨?xì)胞來(lái)源的外排體極大的促進(jìn)了成骨分化，通過(guò)抑制Axin1來(lái)激活Wnt信號(hào)通路，最終促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]。成骨細(xì)胞來(lái)源外排體中的真核起始因子2也能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[15]。免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)對(duì)骨生長(zhǎng)有重要的作用，盡管具體的機(jī)制還不清楚，但外排體在此過(guò)程中可能也起到了一定的作用。樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源外排體通過(guò)傳遞miRNA顯著地增加了間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。然而，哪種細(xì)胞來(lái)源的外排體促成骨作用最強(qiáng)以及外排體如何調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化仍有待研究。

4.2 外排體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和活性

骨中約4%～6%的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，其主要功能是促進(jìn)骨的形成。在骨形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞產(chǎn)生鈣磷基礦物進(jìn)而形成礦化骨。外排體通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活性來(lái)刺激骨再生。前列腺癌細(xì)胞來(lái)源的外排體有更強(qiáng)的骨親和性，使成骨細(xì)胞增殖加快，用該細(xì)胞來(lái)源外排體處理過(guò)的成骨細(xì)胞能產(chǎn)生更多的鈣沉積和更高的ALP(堿性磷酸酶)活性[16]。外排體在體內(nèi)對(duì)成骨細(xì)胞的作用也很顯著，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外排體治療后的顱骨缺損兔模型的骨愈合也明顯改善[17]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步印證了外排體對(duì)成骨細(xì)胞的重要性。

4.3 外排體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞成熟和活性

骨再生和破骨細(xì)胞的異常激活是密切相關(guān)的。腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌外排體增加成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，從而誘導(dǎo)骨溶解。多發(fā)性骨髓瘤來(lái)源的外排體通過(guò)Raw264.7細(xì)胞系和人原始破骨細(xì)胞的內(nèi)化增加破骨細(xì)胞標(biāo)志物(cathepsin K, metalloproteinases 9和 TRAP)的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟[18]。前列腺癌來(lái)源的外排體能通過(guò)刺激NF-κB(RANK)受體活化劑的表達(dá)來(lái)增加破骨細(xì)胞生成[19]。成熟破骨細(xì)胞也能通過(guò)分泌外排體進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，破骨細(xì)胞來(lái)源的外排體中NF-κB高表達(dá)，抑制外排體中NF-κB表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成受到抑制[20]。

4.4 外排體促血管生成

盡管沒(méi)有研究直接證明外排體在骨中有促血管生成作用，但外排體在其他組織和器官中能刺激血管生成。胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體在體外能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成，此外還能通過(guò)NADH氧化酶、基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶誘導(dǎo)因子來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成[21]。外排體不僅能在體外促進(jìn)血管生成，在體內(nèi)也能增加血管生成能力。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體在不同的動(dòng)物模型中均能提高血管生成能力。尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體能減少心肌缺血和再灌注損傷，在缺血性心臟病動(dòng)物模型中能提高血管生成能力[22]。

5 外排體療法的優(yōu)勢(shì)與不足

5.1 外排體療法的優(yōu)勢(shì)

與細(xì)胞治療相比，外排體療法有很多優(yōu)勢(shì)。外排體療法能避免生物治療所帶來(lái)的細(xì)胞毒性和免疫抑制問(wèn)題[23]。外排體能同時(shí)正向和負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外排體對(duì)宿主有免疫豁免特性。膠質(zhì)瘤來(lái)源的外排體能激活免疫反應(yīng)以便于識(shí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞，很大程度上有助于新型免疫治療的發(fā)展[24]。另外，和細(xì)胞移植相比，外排體療法的并發(fā)癥(腫瘤、血栓形成和GVDH)更少，安全性更強(qiáng)。

5.2 外排體療法的不足

外排體療法應(yīng)用于臨床仍有很多限制。首先分離外排體的方法產(chǎn)量很低，5×106個(gè)骨髓瘤細(xì)胞僅能提供5～6 μg外排體；第二，分離外排體的方法仍然很有爭(zhēng)議，傳統(tǒng)超高速離心法操作費(fèi)時(shí)，提取外排體樣本回收率較低，而ExoQuick與TEI試劑盒提取方法僅適用于血清等稀缺樣本外排體制備[25]。但所有這些方法均不適用于臨床；第三，外排體所攜帶基因信息的確切功能還不明確。外排體中miRNA是其主要的功能成分，來(lái)源不同，外排體攜帶的物質(zhì)也不同。了解注射外排體后其在體內(nèi)的分布對(duì)減小外排體的不良反應(yīng)至關(guān)重要，大部分外排體會(huì)遷移到骨和肺。因此，必須明確外排體的分布和清除，從而更好的評(píng)估其安全性。

6 問(wèn)題與展望

外排體能刺激成骨細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)血管再生和破骨細(xì)胞的活性，在體內(nèi)和體外均能有效的促進(jìn)骨再生。但是由于不同來(lái)源的外排體作用不一，對(duì)靶細(xì)胞的具體作用機(jī)制不清楚；體外分離產(chǎn)量低以及安全性等問(wèn)題限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步研究外排體在骨再生中具體的作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)出有效提取和純化外排體的方法，并探究哪種細(xì)胞和組織來(lái)源的外排體其成骨能力最強(qiáng)。由于現(xiàn)今治療骨再生的方法費(fèi)用高、并發(fā)癥多和療效差，外排體療法將在骨再生臨床治療中開(kāi)辟新的領(lǐng)域。

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