內質網(wǎng)應激在肝臟相關疾病中的研究進展

丁文斌，戴佳敏，張 峰，王學浩，饒建華

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 肝臟外科， 江蘇 南京 210029)

1 ERS概述

內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是一種重要的膜結合細胞器，廣泛存在于各種真核細胞中。主要參與蛋白質、脂質和糖類的合成，細胞內鈣離子的儲存及細胞的解毒作用，尤其在分泌蛋白和膜蛋白的合成、儲存、加工修飾、折疊、組裝及運輸方面發(fā)揮極其重要的作用。此外，內質網(wǎng)又是一個非常敏感的細胞器，任何干擾其代謝平衡的因素，如低氧、氧化應激、細胞內營養(yǎng)物缺乏、代謝障礙、高濃度同型半胱氨酸、病毒感染、藥物及突變基因等均能引起內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。ERS主要涉及未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在ER內聚集，可進一步激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，通過下游信號通路，或重建內質網(wǎng)正常代謝平衡，或誘導細胞凋亡[1]。在哺乳動物細胞ERS過程中，主要通過3條信號傳導通路激活UPR， 每一條通路各涉及一種內質網(wǎng)膜蛋白， 分別為1型ER轉膜蛋白激酶α(type- 1 ER transmembrane protein kinase, IRE1α)，活化轉錄因子6α(activating transcription factor 6α, ATF6α)及雙鏈RNA依賴的蛋白激酶ER激酶(PER like ER kinase, PERK)。

IRE1α是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其腔內部分具有Ser/Thr 受體蛋白激酶活性和特異性核酸內切酶活性，是激活UPR的最保守信號通路中的重要組成部分。ERS時，IRE1α的腔內部分通過同源寡聚和反式自身磷酸化激活其特異性核酸內切酶活性，特異性地剪接 XBP1/mRNA，產生關鍵轉錄激活因子XBP1s。XBP1s進一步激活許多UPR相關基因，生成某些蛋白質和分子伴侶，在調節(jié)內質網(wǎng)蛋白質的折疊和運輸，脂質的合成，內質網(wǎng)膜的擴展及ER相關性蛋白降解(ERAD)等方面發(fā)揮重要作用。IRE1α-Xbp1通路是與細胞應激相關的多種信號通路的匯合點。IRE1α可通過與TNFα相關受體2(TRAF2)結合并使其磷酸化，進而激活NF-κB通路和JNK通路，誘導炎性反應產生和細胞凋亡；IRE1α還可與線粒體外膜上的凋亡相關蛋白Bax和Bak結合，導致線粒體依賴性死亡的產生。IRE1α不僅對XBP1/mRNA有特異性核酸內切酶活性，而且對ER mRNA的其他多個位點發(fā)揮同樣作用，產生依賴IRE1α調節(jié)性降解作用(RIDD)，激活ERS[2]。

PERK也是一種具有Ser/Thr受體蛋白激酶活性的Ⅰ型跨膜蛋白，它屬于真核細胞翻譯啟動子2α(eIF2α)蛋白激酶家族,其激活UPR的過程與IRE1α激活UPR的過程相似。ERS時，PERK自身磷酸化激活eIF2α，減少蛋白質的翻譯及內質網(wǎng)內蛋白質的折疊，從而降低蛋白質的合成。同時eIF2α還可促進轉錄因子ATF4的翻譯，而ATF4與許多應激反應通路，UPR相關炎癥信號分子的表達，ER分子伴侶及其運輸，抗氧化應激反應及細胞自噬等有著緊密關系。ATF4還能促進下游增強子結合性蛋白同源蛋白(CHOP)的表達。CHOP不僅能激活ER氧化酶1α(ER oxidase 1α, ERO1α)、鈣離子依賴性蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)及其相關通路，促進氧化應激和細胞凋亡的發(fā)生，還與凋亡抑制蛋白Bcl- 2，促凋亡因子Bim，端粒結合蛋白3及死亡受體5聯(lián)系密切。

不同于IRE1α和PERK，ATF6α是一種Ⅱ型跨膜蛋白，屬于RIP-調節(jié)性bZIP轉錄因子蛋白家族，其N末端具有bZIP結構域。ERS時，ATF6α轉移到高爾基體內，由高爾基體膜內蛋白酶SP1和SP2分別對其腔內部分和跨膜部分進行切割，產生游離N末端。游離的ATF6α N末端可轉移到細胞核內，促進UPR相關成分的轉錄。其他RIP-調節(jié)性bZIP轉錄因子還包括CREBH和OASIS，它們廣泛存在于各種組織中，發(fā)揮多種重要功能。

2 ERS與肝臟疾病

2.1 酒精性肝病(ALD)

酒精性肝病是由細胞色素CYP2E1降解乙醇產生毒性代謝產物引起的肝細胞的炎性反應。ERS和胰島素抵抗與ALD的發(fā)生發(fā)展有密切關系。ALD患者的肝細胞存在脂質代謝障礙，導致細胞內神經酰胺的異常聚集，而神經酰胺可以調節(jié)ERS和胰島素抵抗的產生。這使得神經酰胺酶抑制劑有可能成為治療ALD的新手段[3]。酸性鞘磷脂酶(ASMase)在酒精導致的ERS及ALD中發(fā)揮重要作用。ASMase能引起線粒體內膽固醇的積聚，破壞線粒體的結構和功能，使肝細胞更容易受到ERS,氧化應激及炎性因子的破壞,促進ALD的進展[4]。干擾素調節(jié)因子3(IRF3)是一種啟動免疫應答的轉錄調節(jié)因子，IRF3與酒精導致的ERS有密切關系。酒精或酒精導致的ERS能促進IRF3磷酸化，激活促凋亡蛋白Bax，誘導肝細胞凋亡。但當缺乏IRF3啟動子STING時，IRF3無法磷酸化，證明STING-IRF3通路在ALD的進展中發(fā)揮了關鍵作用[5]。此外，細胞內鐵離子的超負荷與ALD的發(fā)生有密切關系。細胞內過多的鐵離子能夠激活IRE- 1α和PERK，促進ERS的發(fā)生。超負荷的鐵離子還可減弱細胞的自噬作用，降低細胞的適應能力，使細胞更易遭受酒精導致的ERS損傷[6]。

2.2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD是代謝綜合征定位在肝臟的表現(xiàn)。其具體發(fā)病機制尚未完全明確。ER是脂質合成的重要場所，目前認為ERS引起的ER脂質代謝障礙及隨之產生大量活性氧簇(ROS)與NAFLD的發(fā)生有關[7]。已證實降脂藥物非諾貝特能改善NAFLD大鼠模型的肝功能，這一作用可能是通過阻斷IRE1α-XBP1-JNK通路，減少ERS的發(fā)生來實現(xiàn)[8]。NAFLD的發(fā)生與胰島素抵抗及2型糖尿病也有密切關系。胰高血糖素樣肽- 1(GLP- 1)是回腸內分泌細胞分泌的一種腦腸肽，目前主要作為2型糖尿病藥物作用的靶點。GLP- 1可能通過ERp46通路抑制ERS的激活，預防NAFLD 的發(fā)生[9]。T細胞受體8(TCR8)屬于內質網(wǎng)E3連接酶家族成員，能調節(jié)脂質和蛋白的合成。相關研究發(fā)現(xiàn)TCR8在NAFLD患者中的表達是降低的。低表達的TCR8可促進eIF2α磷酸化，增加ATF4及CHOP的表達，從而激活ERS，促進NAFLD的進展[10]。自噬功能障礙也在NAFLD中發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死相關因子受體9(CTRP9)能通過AMPK通路介導的自噬作用，減弱ERS的發(fā)生，在NAFLD老鼠模型中起到保護作用[11]。

2.3 中毒性肝損傷

肝臟是藥物、毒物在體內的主要代謝器官。ER是體內生物轉化的重要場所。ER可通過其膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)(主要通過CYP450酶系統(tǒng))將大部分化合物轉化為無活性成分排出體外。但此過程會影響ER的代謝平衡，誘導ERS的產生。故ERS與中毒性肝損傷的進展密切相關。四氯化碳(CCL4)和對乙酰氨基酚(APAP)是誘導中毒性肝損傷最常見的藥物。CCL4經內質網(wǎng)CYP2E1代謝后產生高活性三氯過氧自由基，破壞脂質和蛋白質，引起脂質過氧化及蛋白質的異常聚集。CCL4還能干擾高爾基體代謝平衡及細胞內鈣穩(wěn)態(tài)。這些最終會導致肝細胞的死亡[12]。此外，在APAP誘導的肝損傷動物模型觀察到ATF6、CHOP及caspase- 12的高表達，提示ERS在APAP誘導的中毒性肝損傷中發(fā)揮重要作用[13]。砷也能引起中毒性肝損傷，砷經肝臟轉化產生的代謝產物三價二甲基砷酸(DAMⅢ)可通過PERK相關通路激活ERS，造成肝細胞損傷[14]。據(jù)此推測，ERS可能是中毒性肝損傷中的重要機制。

2.4 病毒性肝炎

目前已證明各種肝炎病毒(包括HBV和HCV)感染后，大量的病毒復制產物蛋白質在ER內異常聚集，可激活UPR，進而引起ERS。HBV的X蛋白(HBx)在ERS中發(fā)揮重要作用。HBx通過激活ATF6和IRE1-Xbp1信號通路，引起UPR[15]。HBV還能通過激活ERAD相關通路引起ERS[16]。另外，ERS可能與HBV表面抗原、e抗原的突變，及抗HBV藥物耐藥性的產生有關[17]。HCV有E1和E2兩種包膜蛋白，E1和E2能通過PERK特異性激活CHOP，引起肝細胞損傷[18]。HCV的核心蛋白可通過EIF2A和ATF6相關通路激活ERS[19]。此外，HCV感染能夠上調細胞因子信號抑制因子3的表達，降低胰島素受體底物1和2的表達，從而激活ERS，并促進胰島素抵抗的發(fā)生[20]。

2.5 肝臟惡性腫瘤

惡性腫瘤以依靠蛋白質合成實現(xiàn)的快速增殖為特征。大多數(shù)實體腫瘤處于低氧環(huán)境，低氧條件下細胞能量代謝受到影響，ATP生成減少，內質網(wǎng)內蛋白質無法正常折疊，從而激活UPR,產生ERS。UPR與多種組織或器官(包括肝臟)的實體腫瘤發(fā)生有密切關系[21]。實體腫瘤的低氧微環(huán)境可激活PERK-eIF2α-ATF4通路，促進血管生成基因、血管內皮生長因子及1型膠原誘導蛋白的表達，確保腫瘤細胞在低氧環(huán)境中生存。ERS時，ATF6及IRE1α-Xbp1相關通路被激活。ATF6的激活進一步激活Rheb-mTOR信號通路，增強腫瘤細胞的生存能力。而IRE1α-Xbp1激活后與抗凋亡蛋白家族成員Bcl- 2和σ- 1受體相互作用，抑制腫瘤細胞凋亡[22]。ERS除了能夠促進腫瘤生長外，亦可抑制腫瘤生長。某些抗腫瘤藥物正是通過激發(fā)ERS導致腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。如CXC195，它可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，激活ERS，促進HCC細胞的凋亡[23]?？垢伟┌邢蛩幬锼骼颇峥赡芤彩峭ㄟ^ERS介導的腫瘤細胞凋亡達到治療肝癌的目的[24]。

2.6 肝臟移植/肝臟缺血再灌注損傷(IRI)

肝臟缺血再灌注損傷目前是引起肝臟移植后患者出現(xiàn)并發(fā)癥或死亡的主要原因。肝臟IRI時，由于氧化還原反應的失衡及ATP的缺乏，ER內蛋白質被氧化，鈣離子大量消耗，干擾ER的正常代謝平衡。大量未折疊和錯誤折疊的蛋白質在ER內聚集，從而激活ERS及UPR。在肝臟IRI的老鼠模型中可觀察到UPR的代表性標志物sXBP1、 cATF6及ATF4的高表達現(xiàn)象，說明ERS在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用。當發(fā)生肝臟IRI時，ERS通過激活Toll樣受體4，促進巨噬細胞分泌大量促炎介質，使肝細胞更易遭受TNF-α的破壞[25]。ERS與脂肪肝供體移植后相關損傷的發(fā)生也有密切關聯(lián)。有關研究顯示ERS的相關成分及肝臟損傷的標志物在接受脂肪肝供體的肝移植老鼠模型中明顯升高。牛磺酸結合性熊去氧膽酸(TUDCA)能減少ERS相關成分的產生，改善脂肪肝供體移植后相關損傷。這可為脂肪肝供體移植后相關損傷的治療提供新方向[26]。該領域的其他研究顯示：ATF6通過調控TLR- 4調節(jié)先天免疫反應促進炎性反應增加肝臟IRI；LPS預處理可通過抑制ATF4-CHOP信號通路抑制肝臟IRI過程炎性反應和肝細胞凋亡；N-乙酰半胱氨酸可通過抑制活性氧化間接抑制ERS減少肝臟IRI過程肝細胞死亡?？傊?，ERS在肝臟IRI損傷中發(fā)揮了重要作用，抑制ERS有望成為減輕肝臟IRI的新策略。

3 小結與展望

ERS是機體的一種自我保護性反應，但過強或過久的ERS會引起細胞內環(huán)境改變，影響細胞正常功能，最終導致細胞凋亡。近年來，許多研究顯示ERS與肝臟相關疾病的發(fā)生及發(fā)展關系密切。對ERS的作用及機制進行研究可進一步了解各種肝臟相關疾病的發(fā)生機制，從而對其實施干預，最終達到治療和預防相關疾病的目的。如通過應用某些藥物阻斷ERS，減少肝細胞的凋亡，減輕肝臟IRI；也可應用某些藥物激活ERS，促進癌細胞的凋亡，達到抗腫瘤的目的。但目前ERS在各種肝臟相關疾病中究竟發(fā)揮多大作用尚未完全明確，ERS干擾藥物的研究也處于起步階段，仍然需要更為深入的研究，以期使ERS成為治療肝臟相關疾病的新靶點，為各種肝臟疾病的治療提供新的思路和方法。

[1] Kelly E, Greene CM, O’Neill SJ,etal.Selenoprotein S/SEPS1 modifies endoplasmic reticulum stress in Z variant {alpha} 1-antitrypsin deficiency[J].J Biol Chem,2009,284:16891- 16897.

[2] Tabas I, Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress[J]. Nat Cell Biol,2011,13:184- 190.

[3] Longato L, Ripp K, Setshedi M,etal. Insulin resistance, ceramide accumulation, and endoplasmic reticulum stress in human chronic alcohol-related liver disease[J]. Oxid Med Cell Longev, 2012,2012:1- 17.

[4] Fernandez A, Matias N, Fucho R,etal. ASMase is required for chronic alcohol induced hepatic endoplasmic reticulum stress and mitochondrial cholesterol loading[J]. J Hepatol,2013,59:805- 813.

[5] Petrasek J, Iracheta-Vellve A, Csak T,etal.STING-IRF3 pathway links endoplasmic reticulum stress with hepatocyte apoptosis in early alcoholic liver disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110:16544- 16549.

[6] Tan TC, Crawford DH, Jaskowski LA,etal. Excess iron modulates endoplasmic reticulum stress-associated pathways in a mouse model of alcohol and high-fat diet-induced liver injury[J]. Lab Invest,2013,93:1295- 1312.

[7] Ashraf NU,Sheikh TA.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J].Free Radic Res,2015,49:1405- 1418.

[8] Zhang N, Lu Y, Shen X,etal.Fenofibrate treatment attenuated chronic endoplasmic reticulum stress in the liver of nonalcoholic fatty liverdisease mice[J]. Pharmacology,2015,95:173- 180.

[9] Ao N,Yang J,Wang X,etal.Glucagon-like peptide- 1 preserves non-alcoholic fatty liver disease through inhibition of the endoplasmic reticulum stress-associated pathway[J]. Hepatol Res,2016,46:343- 353.

[10] Chang PC, Tsai HW, Chiang MT,etal. TRC8 downregulation contributes to the development of non-alcoholic steatohepatitis by exacerbating hepatic endoplasmic reticulum stress[J]. Biochim Biophys Acta,2015,1852:2339- 2351.

[11] Jung TW, Hong HC, Hwang HJ,etal.C1q/TNF-Related Protein 9 (CTRP9) attenuates hepatic steatosis via the autophagy-mediated inhibition of endoplasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Endocrinol,2015,417:131- 140.

[12] Godoy P, Hewitt NJ, Albrecht U,etal.Recent advances in 2D and 3Dinvitrosystems using primary hepato-cytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity,cell signaling and ADMe[J]. Arch Toxicol,2013,87:1315- 1530.

[13] Nagy G, Kardon T, Wunderlich L,etal.Acetaminophen induces ER dependent signaling in mouse liver[J]. Arch Biochem Bio-phys,2007,459:273- 279.

[14] Chen S, Melchior WB, Guo L.Endoplasmic reticulum stress in drug-and environmental toxicant-induced liver toxicity[J]. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev,2014,32:83- 104.

[15] Li B, Gao B, Ye L,etal.Hepatitis B virus X protein (HBx) activates ATF6 and IRE1-Xbp1 pathways of unfolded protein response[J]. Virus Res,2007,124:44- 49.

[16] Lazar C, Macovei A, Petrescu S,etal.Activation of ERAD pathway by human hepatitis B virus modulates viral and subviral particle production[J]. PLoS One,2012,7:1- 11.doi: 10.1371/journal.pone.0034169.

[17] Lee H, Kim H, Lee SA,etal.Upregulation of endoplas-mic reticulum stress and reactive oxygen species by naturally occurring mutations in hepatitis B virus core antigen[J]. J Gen Virol,2015,96:1850- 1854.

[18] Chan SW, Egan PA. Hepatitis C virus envelope proteins regulate CHOP via induction of the unfolded protein response [J]. FASEB J,2005,19:1510- 1512.

[19] Wang J, Kang R, Huang H,etal.Hepatitis C virus core protein activates autophagy through EIF2AK3 and ATF6 UPR pathway-mediated MAP1LC3B and ATG12 expres-sion[J].Autophagy,2014,10:766- 784.

[20] Ahmed QL, Manzoor S, Tariq M,etal.Hepatitis C virus infectioninvitrotriggers endoplasmic reticulum stress and downregulates insulin receptor substrates 1 and 2 through upregulation of cytokine signaling suppressor 3[J].ActaVirol,2014,58:238- 44.

[21] Wang WA, Groenendyk J, Michalak M. Endoplasmic reticulum stress associated responses in cancer[J].Biochim Biophys Acta,2014,1843:2143- 2149.

[22] Ji C.New Insights into the Pathogenesis of Alcohol-Induced ER Stress and Liver Diseases[J]. Int J Hepatol,2014,2014:1- 11.

[23] Chen XL, Fu JP, Shi J,etal.CXC195 induces apoptosis and endoplastic reticulum stress in human hepatocellular carcinoma cells by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signal-ing pathway[J]. Mol Med Rep,2015,12:8229- 8236.

[24] Zhong J, Xiu P, Dong X,etal.Meloxicam combined with sorafenib synergistically inhibits tumor growth of human hepatocellular carcinoma cells via ER stress-related apoptosis[J]. Oncol Rep,2015,34:2142- 2150.

[25] Liu J, Ren F, Cheng Q,etal.Endoplasmic reticulum stress modulates liver inflammatory immune response in the pathogenesis of liver ischemia and reperfusion injury[J]. Transplantation,2012,94:211- 217.

[26] Anderson CD, Upadhya G, Conzen KD,etal.Endoplasmic reticulum stress is a mediator of post transplant injury in severely steatotic liver allografts[J].Liver Transpl, 2011,17:189- 200.