超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉、豬肝及豬尿中的阿托品殘留

胡興娟，吳寧鵬 ，孟 蕾，彭 麗，李慧素，班付國

(1.鄭州大學(xué)，鄭州450001;2.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008)

阿托品(atropine)是從茄科植物顛茄、曼陀羅及莨菪中分離提取的一種M膽堿受體阻斷藥，具有解除平滑肌的痙攣、抑制腺體分泌、解除迷走神經(jīng)對心臟的抑制、興奮呼吸中樞等藥理活性，在獸醫(yī)臨床上主要作為解毒藥，緩解有機(jī)磷中毒的癥狀。但近年來，在生豬的屠宰環(huán)節(jié)，不法商販利用阿托品的另外的一些藥理特點(diǎn)，在豬宰殺前非法注射阿托品，以保水增重，提高宰殺率，從而獲得非法高額利潤。若食用含有阿托品殘留的動物性食品中后，人會出現(xiàn)瞳孔擴(kuò)大、神志模糊、狂躁不安、抽搐、昏迷等癥狀，因食用含有阿托品的豬肉而產(chǎn)生的人群集體中毒的事件也時有報道。因此，為保障畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護(hù)人體健康，建立豬組織及豬尿中阿托品殘留的測定方法是非常必要的。

目前，國內(nèi)外阿托品含量的測定通常采用高效液相色譜(HPLC)［1-2］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［3-4］，并且主要集中在人體血液、尿液、藥物和藥用植物中阿托品的測定，豬組織和豬尿中阿托品的測定方法還未見報道。因此，本研究以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)為檢測手段，建立了豬肉、豬肝及豬尿中阿托品的分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司，型號為 TQS);XP205分析天平(瑞士MettlerToledo公司)，SIGMA 3-30K離心機(jī)(德國Sigma公司);KQ-3200E超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation);MS3 basic渦旋混合器(IKA);Agela Technologies Cleanert?PEP-2固相萃取柱(3CC/60mg)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸為色譜純;阿托品標(biāo)準(zhǔn)品含量為96.5%，購于中國藥品生物制品檢定所;實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20℃下保存，有效期為三個月。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇-0.1%甲酸水(V/V，20∶80)稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈溶液;流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:2 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜參考條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;源溫:150℃;脫溶劑溫度:500℃;錐孔氣流速為150 L/h，脫溶劑氣流速為1000 L/h;定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的碰撞能量參考值見表2。

表2 阿托品保留時間及定性、定量離子對

1.4.3 樣品前處理 稱取豬組織(豬肉、豬肝)2 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)提取液，渦旋 30 s，振蕩 10 min。4000 r/min離心5 min，取上清液。向殘渣中加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)溶液進(jìn)行重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。于50℃下氮吹濃縮至約2 mL，加入8 mL水，混勻。加入5 mL正己烷，震蕩5 min。8000 r/min離心5 min，取下清液，再加入5 mL正己烷，重復(fù)除脂，取下清液，備用。PEP-2固相萃取柱依次用甲醇和水各3 mL活化，將備用液全部過柱后，分別用3 mL水和3 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干。3 mL乙腈洗脫，洗脫液于50℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入甲醇 -0.1%甲酸水(V/V，20∶80)溶液1.0 mL溶解定容，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

量取豬尿2 mL于50 mL離心管中，加入8 mL水，PEP-2柱凈化，凈化步驟同豬組織。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 稱取空白樣品，按照1.4.3處理，

在氮?dú)獯蹈汕埃瑴?zhǔn)確移取阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加入洗脫液中，制得0.2、0.5、1、2、5、10 μg/kg 濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，阿托品在相關(guān)濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

2.2 檢測限和定量限 檢測限:添加一定量的阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥3時，測得阿托品的檢測限為0.2 μg/kg。定量限:添加一定量的阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥10時，測得阿托品的定量限為0.5 μg/kg。

表3 阿托品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 在空白樣品中分別添加0.5、1、2.5 μg/kg三個濃度的阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做5個平行，連續(xù)做3批，其平均回收率、變異系數(shù)如表4所示?？梢钥闯霭⑼衅吩谪i肉、豬肝及豬尿中的批間平均回收率為78.3%～98.2%，批內(nèi)變異系數(shù)在1.8% ～14.1%之間，批間變異系數(shù)在4.3%～11.2%之間。

豬肉空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、豬肉空白溶液、豬肉空白添加樣品提取離子質(zhì)量色譜圖見圖1-圖3。

3 討論與小結(jié)

3.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 實驗采用0.2 mg/L阿托品的標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源正離子模式下，采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行全掃描，確定母離子為［M+H］+，其質(zhì)荷比m/z為290.1。對母離子進(jìn)行子離子全掃描，得到豐度較高的兩個子離子m/z 124.1和m/z 93.0，其中m/z 124.1是母離子失去托品酸(C9H10O3)產(chǎn)生的，該離子失去NH2CH3得到子離子m/z 93.0，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下對其質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。最后選取豐度較強(qiáng)的子離子m/z 124.1作為定量離子，豐度次之的子離子m/z 93.0為定性離子。

3.2 提取液優(yōu)化 提取阿托品時一般使用乙腈［3］、乙酸乙酯［5］或者乙腈和一定比例的0.1%甲酸水溶液［6］作為提取液。本研究比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)對阿托品的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯和甲醇提取的雜質(zhì)較多，且回收率較低;乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)比乙腈的提取效率高，基質(zhì)效應(yīng)較弱。最終選取乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)作為提取液。

圖2 豬肉空白溶液提取離子質(zhì)量色譜圖

圖3 豬肉空白添加阿托品提取離子質(zhì)量色譜圖(1μg/kg)

3.3 凈化條件優(yōu)化 已報道的凈化方法主要是固相萃取法，使用的固相萃取柱主要是 MCX柱［7］。本研究分別考察了MCX、PEP-2和C18固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明MCX柱的凈化效果最好，但是回收率不穩(wěn)定，可能是因為阿托品在堿性條件下易水解，而MCX柱在洗脫時使用了氨水，致使阿托品分解所致。PEP-2和C18柱的回收率較高，但是C18柱在處理過程容易造成柱床干涸而影響結(jié)果的平行性，因此最終選擇PEP-2小柱進(jìn)行固相萃取凈化。本研究還對洗脫液和淋洗液進(jìn)行了考察，分別用乙腈和甲醇洗脫待測物，結(jié)果表明，乙腈洗脫時阿托品的回收率最高，因此選擇乙腈作為洗脫液;分別用3 mL水、5%甲醇水、10%甲醇水、15%甲醇水和20%甲醇水進(jìn)行淋洗，結(jié)果顯示，10%甲醇水淋洗液中即含有少量的阿托品，為更好的除去水溶性和部分脂溶性雜質(zhì)，最后選擇3 mL水和3 mL 5%甲醇水作為淋洗液。

3.4 基質(zhì)效應(yīng) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的原因是基質(zhì)中的非揮發(fā)性組分與待測物質(zhì)在霧滴表面離子化的過程中產(chǎn)生競爭，從而影響電噴霧接口的離子化效率［8］，包括基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制。本研究以豬肉、豬肝、豬尿為基質(zhì)空白，比較研究了各種基質(zhì)對阿托品的影響情況。結(jié)果表明，各個樣品基質(zhì)對阿托品的離子化都有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，抑制率在32.0% ～60.0%之間。因此，本方法選擇以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行分析，消除基質(zhì)效應(yīng)對樣品定量的影響。

3.5 小結(jié) 本研究首次建立了以UPLC-MS/MS為檢測手段測定豬組織和豬尿中阿托品的的分析方法，該方法具有靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于豬肉、豬肝和豬尿中阿托品殘留的測定。

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