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    低氧對肌腱細胞基因表達譜的影響

    2014-11-01 21:25:37劉麗麗楊檸澤張延潔王志軍
    中國美容整形外科雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:低氧肌腱引物

    劉麗麗, 楊檸澤, 張延潔, 王志軍

    實驗研究

    低氧對肌腱細胞基因表達譜的影響

    劉麗麗, 楊檸澤, 張延潔, 王志軍

    目的探討低氧對肌腱細胞基因表達譜的影響。方法酶消化法分離得到的肌腱細胞分別在低氧(2%O2)和常規(guī)氧濃度(21%O2)下進行培養(yǎng),第1代肌腱細胞進行表達譜檢測,并用RT-PCR對其中4個差異表達基因進行驗證。結(jié)果低氧培養(yǎng)組與常規(guī)氧濃度組相比,有40個基因表達差異,且全部在低氧組表達上調(diào)。選取的4個差異表達基因的RT-PCR的驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。結(jié)論低氧促進肌腱細胞增殖涉及多個基因參與。

    低氧; 肌腱細胞; cDNA芯片; 基因表達譜

    肌腱細胞是最早用于構(gòu)建組織工程肌腱的種子細胞;它來源于肌腱,構(gòu)建出的組織在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面,與正常肌腱更加相似。但是由于取材面積較小分離得到的肌腱細胞數(shù)量有限,且作為終末分化細胞,肌腱細胞體外培養(yǎng)增殖相對緩慢,隨著傳代次數(shù)的增加,細胞表型逐漸消失,分泌細胞外基質(zhì)能力下降,所以如何促進肌腱細胞增殖和維持其表型、功能,是肌腱組織工程的一個重要研究內(nèi)容。目前,除了常用的添加生長因子(IGF-Ⅰ、BMPs、bFGF、PDGF等)、施加力學(xué)刺激或應(yīng)用富含血小板的血漿(platelet rich plasma-clot release, PRCR)等方法外[1-3],低氧培養(yǎng)也越來越受到重視。目前的研究表明,低氧培養(yǎng)可以明顯促進肌腱(干)細胞增殖[4-5〗,但對其促增殖的機制尚缺乏充分的認識??紤]到細胞增殖是一個涉及多基因、多水平調(diào)控的過程,因此,自2012年始,筆者研究采用表達譜芯片這一常用的高通量檢測技術(shù),對低氧培養(yǎng)的肌腱細胞進行檢測分析。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與主要試劑

    新生1周左右的小豬3只,購自上海市甲干實驗動物中心。 DMEM培養(yǎng)液(美國HYCLONE公司);青霉素-鏈霉素溶液和胰蛋白酶(美國GIBCO公司);膠原酶(德國SERVA公司);胎牛血清(BioWest,BioSun); CO2培養(yǎng)箱(美國THERMO FORMA公司);低氧培養(yǎng)箱(德國BINDER公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 肌腱細胞的分離和體外培養(yǎng) 無菌條件下取新生小豬后足趾深屈肌腱,修除腱周組織后將肌腱剪碎,置于0.2%膠原酶NB4中37 ℃振蕩消化,接種于培養(yǎng)皿(此即原代P0),置于低氧培養(yǎng)箱(2%O2,實驗組)或常規(guī)的CO2培養(yǎng)箱(21% O2,對照組)培養(yǎng)并傳代;P1用于芯片分析和RT-PCR檢測。

    1.2.2 總RNA提取、純化和芯片檢測 所用芯片為NimbleGen豬表達譜芯片(美國ROCHE NIMBLEGEN公司),由北京博奧生物有限公司進行芯片檢測,大致流程如下:Trizol提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA并進行純化Cy3標(biāo)記,與芯片42 ℃雜交過夜。NimbleGen MS 200 Microarray Scanner掃描獲取熒光信號強度值,NimbleScan 2.6軟件進行圖像分析。芯片顯著性分析(significance analysis of microarrays, SAM)R程序包進行差異表達基因的篩選。差異倍數(shù)>2,且q≤ 5%(q值表示該基因被判斷為差異基因時的錯誤發(fā)現(xiàn)率,類似于P值。差異越顯著,q值越小)的基因認為是差異表達基因。

    1.2.3 RT-PCR驗證 按總RNA提取試劑盒操作步驟,提取實驗組和對照組P1的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進行以下基因的擴增驗證:IGF2(insulin-like growth factor 2)、IGFBP3(insulin-like growth factor binding protein 3)、TN-X(tenascin-X)、RERG(ras-like, estrogen-regulated, growth inhibitor)和β-actin(內(nèi)參)。各基因引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。

    表1 RT-PCR引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小

    Tab1 RT-PCR primer sequences, annealing temperature and product size

    基因引物序列(5'-3')退火溫度/℃產(chǎn)物大小(bp)IGF2F:ACACCCTCCAGTTTGTCTGCG65109R:CAGCTACGGAAGCAGCACTCTIGFBP3F:GGCATCCACATCCCCAACT58145R:CCCCTTTCCCCTTCACGTN-XF:CCCATAGAGCCCGTTGAGGT65532R:GGACTGTGGGGAGGAGATGCRERGF:ATGGCTAAAAGTGCGGAGGT53600R:CTAACTACTGATTTTGGTGAβ-actinF:CCACCGCAAATGCTTCTAG60208R:GCTGTCACCTTCACCGTTCC

    注:F表示Forward(正向引物),R表示Reverse(反向引物)

    2 結(jié)果

    2.1 RNA抽提質(zhì)量檢測

    6個樣本的RNA A260/280為1.80~2.05;經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測,RNA樣品電泳條帶清晰,28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1。RNA純度、總量及完整性均符合表達譜芯片實驗要求。

    2.2 芯片雜交質(zhì)量判定

    芯片雜交信號均一;Alignment Oligo的雜交信號值正常,表明雜交反應(yīng)成功;STC結(jié)果表明,樣品雜交過程不存在交叉污染。

    2.3 差異表達基因

    芯片檢測結(jié)果顯示,低氧條件下培養(yǎng)的P1與常規(guī)氧濃度組相比,有40個基因表達差異,且全部在低氧組表達上調(diào)(表2)。

    2.4 RT-PCR驗證

    凝膠電泳結(jié)果顯示,低氧組IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表達,均不同程度地高于常規(guī)氧濃度組(圖1),與基因芯片檢測結(jié)果相符。

    圖1 RT-PCR檢測IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表達

    Fig1 RT-PCR detection of the expression of IGF-2, IGFBP-3, TN-X and the RERG.

    3 討論

    迅速擴增肌腱細胞并維持其表型,一直是肌腱組織工程研究的內(nèi)容之一??紤]到肌腱是一種少血管的致密結(jié)締組織,我們推測,其生理環(huán)境應(yīng)該是低氧狀態(tài),因此,我們的前期研究使用了2%O2培養(yǎng)肌腱細胞,結(jié)果表明,低氧可以明顯促進肌腱細胞增殖和維持其表型功能。近年來,越來越多的研究均使用低氧培養(yǎng)各種類型的細胞,多數(shù)研究結(jié)果顯示,低氧可以促進細胞增殖[6],但關(guān)于促增殖的機制研究相對較少,且多為短期培養(yǎng)細胞(3~72 h)增殖的機制研究[7]。由于構(gòu)建組織需要大量的種子細胞,所以培養(yǎng)時間至少要1周以上,因此,我們對培養(yǎng)時間至少1周的第1代肌腱細胞,進行了表達譜芯片的檢測,以尋找較長時間低氧濃度促進肌腱細胞增殖的有關(guān)基因,以便為深入研究機制打下基礎(chǔ)。

    芯片檢測結(jié)果顯示,有40個基因表達發(fā)生改變,與其他研究結(jié)果相比,本研究檢測到的差異表達基因數(shù)目較少。我們推測,其主要原因可能在于低氧持續(xù)時間的不同。如上所述,低氧培養(yǎng)細胞基因表達譜的研究,多為短期培養(yǎng)的細胞,處于低氧早期的細胞應(yīng)該有大量的基因表達改變,以適應(yīng)低氧環(huán)境。而隨著低氧時間的延長,細胞已進入適應(yīng)期,因此表達改變的基因數(shù)目會下降。此外,細胞類型和低氧濃度的不同,也可能是研究結(jié)果差異的原因。

    生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),40個差異表達基因中,部分基因與細胞增殖凋亡有關(guān),我們選取的4個RT-PCR驗證基因IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG,也涉及影響細胞的增殖或凋亡。

    IGFBP-3是IGFBPs蛋白家族的成員。它可以結(jié)合體內(nèi)90%以上的IGF-1,也可以結(jié)合IGF-2,通過形成復(fù)合物而延長IGFs的半衰期。IGFs具有促進細胞增殖的作用,但IGFBP-3在不同的細胞微環(huán)境中,具有不同的功能,即促進細胞增殖或促進細胞凋亡;在同樣的細胞內(nèi),也可以作為抑制因子或刺激因子發(fā)揮不同的作用[8]。本研究的芯片檢測結(jié)果顯示,IGF-1表達無明顯改變,而低氧組IGF-2和IGFBP3表達上調(diào)。因此,該3種因子在低氧促進肌腱細胞增殖過程中的作用機制,需要深入研究。

    表2 40個差異表達基因(低氧培養(yǎng)組表達上調(diào))

    注:根據(jù)差異倍數(shù)從大到小排序

    Tenascin-X(TN-X)屬于tenascin蛋白家族,除了TN-X以外,還有TN-C, TN-R和TN-W,均是細胞外基質(zhì)成分。TN-X在肌腱、韌帶和周圍神經(jīng)高表達。研究發(fā)現(xiàn),TN-X與骨骼肌、心臟等多種組織發(fā)育有關(guān),其缺失可導(dǎo)致膠原密度下降[9]。另外有研究結(jié)果顯示,TN-X可以與VEGF結(jié)合并協(xié)同作用,促進血管內(nèi)皮細胞增殖[10]。低氧可以促進血管生成,我們的芯片檢測結(jié)果顯示,低氧組TN-X表達上調(diào),可能與促血管生成有關(guān)。但TN-X是否還與肌腱細胞增殖直接相關(guān),尚需深入研究。

    RERG是一個在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的基因,該基因與ras相關(guān)且受雌激素調(diào)節(jié),主要起抑制細胞增殖和分化的作用。從RERG抑制細胞增殖的角度看,與本研究低氧組RERG表達上調(diào)而低氧又促進肌腱細胞增殖的結(jié)果相矛盾,因此,該基因在低氧促進肌腱細胞增殖過程中究竟有何作用,需要進一步研究。

    綜上所述,本研究通過表達譜芯片的檢測和RT-PCR的驗證發(fā)現(xiàn),與常規(guī)氧濃度培養(yǎng)組相比,低氧條件下培養(yǎng)的肌腱細胞部分基因表達上調(diào),其中一些基因和細胞增殖凋亡有關(guān)。

    [1] Costa MA, Wu C, Pham BV, et al. Tissue engineering of flexor tendons: optimization of tenocyte proliferation using growth factor supplementation[J]. Tissue Eng, 2006,12(7):1937-1943.

    [2] Yang G, Crawford RC, Wang JH. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions[J]. J Biomech, 2004,37(10):1543-1550.

    [3] Wang X, Qiu Y, Triffitt J, et al. Proliferation and differentiation of human tenocytes in response to platelet rich plasma: an in vitro and in vivo study [J]. J Orthop Res, 2012,30(6):982-990.

    [4] Zhang Y, Wang B, Zhang WJ, et al. Enhanced proliferation capacity of porcine tenocytes in low O2tension culture[J]. Biotechnol Lett, 2010,32(2):181-187.

    [5] Lee WY, Lui PP, Rui YF. Hypoxia-mediated efficient expansion of human tendon-derived stem cells in vitro[J]. Tissue Eng, 2012,18(5-6):484-498.

    [6] Yoshida Y, Takahashi K, Okita K, et al. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2009,5(3):237.

    [7] Zhu LL, Zhao T, huang X, et al. Gene expression profiles and metabolic changes in embryonic neural progenitor cells under low oxygen[J]. Cell Reprogram, 2011,13(2):113-120.

    [8] Leibowitz BJ, Cohick WS. Endogenous IGFBP-3 is required for both growth factor-stimulated cell proliferation and cytokine-induced apoptosis in mammary epithelial cells[J]. J Cell Physiol, 2009,220(1):182-188.

    [9] Voermans NC, Verrijp K, Eshuis L, et al. Mild muscular features in tenascin-X knockout mice, a model of Ehlers-danlos syndrome[J]. Connect Tissue Res, 2011,52(5):422-432.

    [10] Ikuta T, Ariga H, Matsumoto K. Extracellular matrix tenascin-X in combination with vascular endothelial growth factor B enhances endothelial cell proliferation[J]. Genes Cells, 2000,5(11):913-927.

    Effectofhypoxiaonthegeneexpressionprofilingoftenocytes

    LIULi-li,YANGNing-ze,ZHANGYan-jie,etal.

    (DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,XinhuaHospital,DalianUniversity,Dalian116021,China)

    ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the gene expression profiling of tenocytes.MethodsTenocytes were isolated by enzymatic digestion and cultured in hypoxic (2%O2) or normoxic (21%O2) condition. Tenocytes gene expression profiling of Passage 1 were analyzed by cDNA microarray, and the selected four differentially expressed genes expressions were verified by RT-PCR.ResultsThere were 40 differences on gene expression between hypoxic and normoxic tenocytes, and all of which were up-regulated in hypoxic group. RT-PCR validation was consistent with microarray results.ConclusionMultiple genes were involved in tenocytes proliferation under hypoxia.

    Hypoxia; Tenocytes; cDNA microarray; Gene expression profiling

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81101447)

    116021 遼寧 大連,大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 整形外科(劉麗麗,楊檸澤,王志軍);昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系(張延潔)

    劉麗麗(1985-),女,黑龍江牡丹江人,碩士研究生.

    王志軍,116021,大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 整形外科,電子信箱:wzy618@tom.com

    10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.018

    R318

    A

    1673-7040(2014)08-0499-04

    2014-04-21)

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