Cdc42在種植體納米化影響成骨細(xì)胞功能中的作用

趙震錦， 馮翠娟， 田玉樓， 陳鈺文， 張 揚(yáng)

實(shí)驗(yàn)研究

Cdc42在種植體納米化影響成骨細(xì)胞功能中的作用

趙震錦， 馮翠娟， 田玉樓， 陳鈺文， 張 揚(yáng)

目的研究Cdc42在納米化種植體促進(jìn)成骨細(xì)胞功能中的作用。方法將納米化種植體與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，通過(guò)Western Blot檢測(cè)Cdc42活性蛋白含量，以及熒光染色檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)F-actin分布，掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)，MTT檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖。結(jié)果納米化種植體使成骨細(xì)胞內(nèi)Cdc42活性蛋白含量明顯增多，Toxin B抑制后其活性明顯下降，納米化種植體表面成骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞骨架明顯，伸出較多偽足，采用Toxin B處理后細(xì)胞形態(tài)變圓，偽足減少。成骨細(xì)胞增殖功能隨種植體納米化而明顯增高，在Toxin B處理后下降。結(jié)論種植體粗化使Cdc42表達(dá)增加，可能通過(guò)Cdc42調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的黏附及增殖。

納米化種植體； Cdc42； 成骨細(xì)胞

為提高種植體支抗的穩(wěn)定性，改變鈦表面的物理形態(tài)或化學(xué)組成，將生物惰性鈦金屬改造成生物活性材料是長(zhǎng)期以來(lái)學(xué)者們一直追尋的目標(biāo)。為此，研究者采用了多種鈦種植體表面處理技術(shù)，來(lái)提高種植體與骨結(jié)合的速度和強(qiáng)度，如表面噴砂技術(shù)、羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)及磷酸三鈣(tricalcium phosphate, TCP)表面涂層技術(shù)、陽(yáng)極氧化技術(shù)和噴砂加酸蝕表面處理技術(shù)等[1-3]。學(xué)者們[4-5]對(duì)種植體鈦片進(jìn)行表面納米化處理增加其生物學(xué)活性，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附、增殖及種植體的穩(wěn)定性，認(rèn)為納米化材料所形成的納米級(jí)孔隙更加有利于成骨細(xì)胞絲足及偽足的附著，但對(duì)于其內(nèi)在信號(hào)通路機(jī)制未進(jìn)行深入探討。研究結(jié)果顯示,種植體表面粗化對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架有影響[5-6]，而Cdc42在多種細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附[7-8]，為此筆者對(duì)Cdc42/細(xì)胞骨架在種植體納米化調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能的機(jī)制中的作用進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 實(shí)驗(yàn)材料：人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63，購(gòu)自北京基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，種植體材料由東北大學(xué)材料電磁過(guò)程研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室佟偉平惠贈(zèng)并進(jìn)行表面粗化。實(shí)驗(yàn)前均常規(guī)超聲清洗、烘干、濕熱法消毒。實(shí)驗(yàn)試劑：MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，MTT試劑(美國(guó)AMRESCO公司)，Triton-100(0.2%)和TRITC-labeled phalloidin(美國(guó)SIGMA公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 共分3組。對(duì)照組(C組)：成骨細(xì)胞與光滑種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)；納米化組(N組)：成骨細(xì)胞與納米化的種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)；Toxin B組(T組)：成骨細(xì)胞采用Toxin B處理3 h后再與表面納米化的種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)。

1.3 觀察Cdc42活性蛋白表達(dá) 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后，收集成骨細(xì)胞，用1%NP- 40緩沖液裂解細(xì)胞，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，收集上清液中加入結(jié)合GST-p21-PAK融合蛋白的谷胱甘肽Sepharose 4B瓊脂糖珠，旋轉(zhuǎn)混合儀上4 ℃過(guò)夜用于沉淀活化的Cdc42，加熱變性，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及化學(xué)發(fā)光顯色，使用兔抗Cdc42多克隆抗體(P1)進(jìn)行Western Blot，檢測(cè)各組種植體表面成骨細(xì)胞內(nèi)Cdc42活性蛋白的表達(dá)，采用Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.4 觀察Cdc42對(duì)F- actin的影響 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后甲醛固定，Triton X-100室溫透膜，TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽37°染色30 min，熒光顯微鏡觀察肌動(dòng)蛋白分布。

1.5 觀察Cdc42對(duì)成骨細(xì)胞在種植體表面的形態(tài)及增殖黏附的影響 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞的形態(tài)改變； 在1、4、7 d分別棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml) 4 h，吸凈MTT，加入150 μl DMSO，輕輕震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值(A)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 納米化種植體對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)Cdc42活性蛋白含量的影響 在納米化種植體表面的成骨細(xì)胞內(nèi)Cdc42活化水平明顯增高，而Toxin B預(yù)處理部分抑制Cdc42活化(圖1)。

2.2 Cdc42對(duì)納米化種植體表面成骨細(xì)胞形態(tài)及肌動(dòng)蛋白濃聚的影響 納米化種植體表面成骨細(xì)胞伸展，偽足形成，肌動(dòng)蛋白聚合，Toxin B預(yù)處理后肌動(dòng)蛋白聚合減少，細(xì)胞形態(tài)變圓，偽足減少，顯示Cdc42可能參與這個(gè)過(guò)程(圖2)。

2.3 Cdc42對(duì)成骨細(xì)胞在種植體表面增殖的影響 在復(fù)合培養(yǎng)5 d后，納米化種植體表面細(xì)胞黏附增殖水平明顯高于對(duì)照組，Toxin B處理后細(xì)胞黏附增殖水平降低。這說(shuō)明，移植料表面成骨細(xì)胞黏附增值水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增高。見(jiàn)表1。

3 討論

錯(cuò)牙合畸形治療過(guò)程中支抗的控制非常重要，納米種植體的出現(xiàn)為正畸臨床提供了“絕對(duì)”支抗，擴(kuò)大了正畸矯治的適應(yīng)證[1，9-10],因此，學(xué)者們對(duì)納米種植體進(jìn)行了大量研究。目前,學(xué)者們采取了多種方法如鈦漿噴涂、酸蝕、噴砂、陽(yáng)極氧化等來(lái)進(jìn)行種植體的表面處理[2-5，11-13]。有學(xué)者[4-5]進(jìn)行各種表面處理的目標(biāo)，是種植體表面的納米化，從而增加其生物學(xué)活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖及種植體的穩(wěn)定性。學(xué)者們[3，5]認(rèn)為，納米化材料所形成的納米級(jí)孔隙更加有利于成骨細(xì)胞絲足及偽足的附著，但對(duì)于其內(nèi)在信號(hào)通路機(jī)制沒(méi)有進(jìn)行深入探討。本研究采用納米化純鈦種植體材料進(jìn)行的前期研究工作[5]已經(jīng)證明，種植體納米化對(duì)成骨細(xì)胞功能及黏附的影響，細(xì)胞骨架有所改變，但影響成骨細(xì)胞遷移細(xì)胞骨架改變的分子機(jī)制尚不清楚。

圖1 免疫沉淀Western Blot檢測(cè)Cdc42活性蛋白水平圖2 掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)(SEM ×2000) a. C組 b. N組 c. T組

Fig1 Level of Cdc42 detected by Western Blot.Fig2 Morphology of osteoblast (SEM ×2000). a. Group C. b. Group N. c. Group T.

表1 各組成骨細(xì)胞黏附增殖測(cè)定結(jié)果

注：*與C組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；#與N組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

Rho GTPase家族成員中的Racl和Cdc42對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架都有其特異的生物效應(yīng)，我們先期的研究成果表明[7]，受到外界刺激后，細(xì)胞骨架改變定向遷移主要涉及PI3K活化，通過(guò)Rac/cdc42導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合，使細(xì)胞發(fā)生定向遷移及黏附。因此，我們檢測(cè)了Cdc42在納米化種植體促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附及調(diào)節(jié)功能過(guò)程中的作用。本研究中，我們證實(shí)Cdc42是參與納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能及黏附的信號(hào)分子。結(jié)果顯示，納米化種植體表面活性Cdc42蛋白水平增高。Rho GTPases通過(guò)活性(GTP結(jié)合)及非活性(GDP結(jié)合)形式之間的轉(zhuǎn)換，控制細(xì)胞生理過(guò)程，扮演“分子開(kāi)關(guān)”的角色[7-8]?；钚訡dc42含量的增高，支持了Cdc42在納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能機(jī)制參與的可能性。

細(xì)胞骨架的形態(tài)反應(yīng)了細(xì)胞與種植體表面結(jié)合的能力，在種植體經(jīng)過(guò)表面處理且增加生物學(xué)活性后，其表面細(xì)胞通常伸展，形態(tài)不規(guī)則，偽足增加[13-15]。我們的結(jié)果顯示也如此，但將成骨細(xì)胞采用Cdc42拮抗劑Toxin B處理后，細(xì)胞在納米化種植體表面黏附能力減弱，細(xì)胞形態(tài)近似圓形，偽足減少，說(shuō)明Cdc42可能影響成骨細(xì)胞向種植體表面的遷移及黏附，Cdc42/Actin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在種植體表面成骨細(xì)胞吸附和遷移的過(guò)程中扮演重要角色。同樣，成骨細(xì)胞采用Cdc42拮抗劑Toxin B處理后，成骨細(xì)胞在納米化種植體表面的增殖能力明顯降低，顯示Cdc42參與納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖功能的機(jī)制[15]。

目前，對(duì)納米種植體的臨床應(yīng)用研究較多，對(duì)其骨結(jié)合的內(nèi)在機(jī)制研究較少。通過(guò)進(jìn)行相關(guān)研究，以了解Cdc42/Actin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)成骨細(xì)胞遷移、黏附的影響，有利于促使種植體骨整合，提高種植體的成功率，使之在正畸臨床中能更加有效地發(fā)揮作用。

[1] Upadhyay M, Yadav S, Nagaraj K, et al. Mini-implants vs fixed functional appliances for treatment of young adult Class Ⅱ female patients[J]. Angle Orthod, 2011,82(2):294-303.

[2] Jin S, Zhang Y, Wang Q, et al. Influence of TiN coating on the biocompatibility o medical NiTi alloy[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2013,101(1):343-349.

[3] Sato M, Aslani A, Sambito MA, et al. Nanocrystalline hydroxyapatite/titania coatings on titanium improves osteoblast adhesion[J]. J Biomed Mater Res A, 2008,84(1):265-272.

[4] González-García R, Monje A, Fernández-Calderón MC, et al. Three-dimensional and chemical changes on the surface of a 3-year clinically retrieved oxidized titanium dental implant[J]. J Mech Behav Biomed Mater, 2014,34:273-282.

[5] 趙震錦, 張 翀, 張 揚(yáng), 等. 表面粗糙度對(duì)種植體鈦片表面成骨細(xì)胞的影響[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2008,14(2):178-182.

[6] Wu X, Liu X, Wei J, et al. Nano-TiO2/PEEK bioactive composite as a bone substitute material: in vitro and in vivo studies[J]. Int J Nanomedicine, 2012,7:1215-1225.

[7] Zhao ZJ, Liu FY, Li P, et al. CCL19-induced chemokine receptor 7 activates the phosphoinositide-3 kinase-mediated invasive pathway through Cdc42 in metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Oncol Rep, 2001,25(3):729-737.

[8] Gao L, Gorski JL, Chen CS. The Cdc42 guanine nucleotide exchange factor FGD1 regulates osteogenesis in human mesenchymal stem cells[J]. Am J Pathol, 2011,178(3):969-974.

[9] 宛莉娜, 趙震錦, 陳鈺文, 等. 愈合時(shí)間對(duì)微螺釘種植體-骨結(jié)合方式的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,42(5):425-428.

[10] 宛莉娜, 趙震錦, 邢慶昱, 等. 愈合期對(duì)微螺釘種植體-骨界面壓力側(cè)與非壓力側(cè)的影響[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013,22(8):683-688.

[11] 劉慧穎, 王學(xué)金, 王浪平, 等. 氟離子注入純Ti表面改性對(duì)成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原形成和表達(dá)的影響[J]. 金屬學(xué)報(bào), 2008,44(12):1485-1490.

[12] 張 翀, 趙寶紅, 趙震錦, 等. HA涂層-多孔TiO2 MAO鈦基體梯度涂層對(duì)MG63的影響[J]. 上海口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2009,18(4):411-414.

[13] Biggs MJ, Richards RG, Gadegaard N, et al. The use of nanoscale topography to modulate the dynamics of adhesion formation in primary osteoblasts and ERK/MAPK signalling in STRO-1+ enriched skeletal stem cells[J]. Biomaterials, 2009,30(28):5094-5103.

[14] Uggeri J, Guizzardi S, Scandroglio R, et al. Adhesion of human osteoblasts to titanium: A morpho-functional analysis with confocal microscopy[J]. Micron, 2010,41(3):210-219.

[15] Yamashita D, Machigashira M, Miyamoto M, et al. Effect of surface roughness on initial responses of osteoblast-like cells on two types of zirconia[J]. Dent Mater J, 2009,28(4):461-470.

RoleofCdc42infunctionofosteoblastonnano-phasetitaniumimplantmaterials

ZHAOZhen-jin,FENGCui-juan,TIANYu-lou,etal.

(DepartmentofOrthodontic,SchoolofStomatology,ChinaMedicalUniversity,LiaoningInstituteofDentalResearch,Shenyang110002,China)

ObjectiveTo investigate the role of Cdc42 in osteoblast function on nanophase-implant.MethodsThe osteoblast-like cell line MG63 was cultured on normal/nano-phase implants. The levels of activated Cdc42 were measured by the GTPase activity pull-down assay and western blot. Changes of actin cytoskeleton and morphological characteristics were observed by confocal laser scanning microscope (CLSM) and scanning electron microscope (SEM) respectively. Cell proliferation was detected by MTT.ResultsThe activation level of Cdc42 was increase when cultured on nano-phase implant and blocked by Toxin B treatment. The shape of osteoblast attached on implant was irregular with extended pseudopodium. After treated with Toxin B, the shape of cell tended to be round and pseudopodium decreased. The proliferation of osteoblast was increased when cultured on nano-phase implant but decreased after pretreatment by Toxin B.ConclusionNano-phase implant could increase the impression of active Cdc42. Nano-phase implant might improve the proliferation and inhesion of osteoblast through Cdc42.

Nano- phase implant; Cdc42; Osteoblast

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(200925010-29)

110002 遼寧 沈陽(yáng),中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔正畸科

趙震錦(1975-)，女，遼寧黑山人，副教授，副主任醫(yī)師，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.017

R329.2

A

1673-7040(2014)08-0496-03

2014-03-21)