體外擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞的衰老及成骨分化能力的影響

張?zhí)戽? 郭 澍, 于艷秋, 王晨超, 孫 強(qiáng)

實(shí)驗(yàn)研究

體外擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞的衰老及成骨分化能力的影響

張?zhí)戽? 郭 澍, 于艷秋, 王晨超, 孫 強(qiáng)

目的探討體外擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞的衰老及成骨分化能力的影響。方法分離提取兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞，取第5、10、15代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，并采用茜素紅染色法比較不同代數(shù)細(xì)胞的成骨能力，β-半乳糖苷酶染色法比較不同代數(shù)細(xì)胞的衰老程度。結(jié)果早期代數(shù)的細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)的時(shí)間較早，且在同一誘導(dǎo)時(shí)間下，與晚期代數(shù)的細(xì)胞相比，形成的結(jié)節(jié)數(shù)量最多、體積最大。隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量呈下降趨勢(shì)，衰老細(xì)胞所占的比例呈上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論隨體外擴(kuò)增培養(yǎng)，兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞成骨分化能力減弱，細(xì)胞發(fā)生衰老程度增強(qiáng)。

脂肪來(lái)源干細(xì)胞； 擴(kuò)增； 衰老； 成骨

臨床上因先天畸形、創(chuàng)傷及腫瘤等原因造成的顱頜面部骨性缺損，大大降低了患者的生活質(zhì)量，骨缺損的重建是亟待解決的問(wèn)題。骨組織工程的出現(xiàn)為骨缺損的修復(fù)開(kāi)辟了一條新道路，其中脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)作為新生的種子細(xì)胞，在組織工程的研究中得到了廣泛的關(guān)注[1-4]。但是，有限的細(xì)胞數(shù)量需要體外擴(kuò)增來(lái)培養(yǎng)一定量的細(xì)胞，供實(shí)驗(yàn)研究[5-6]。本實(shí)驗(yàn)于2013年9月，從兔的脂肪組織中提取出ADSCs，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，即長(zhǎng)期傳代，探討體外擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)兔ADSCs的衰老及成骨分化能力的影響，以期為基礎(chǔ)研究提供理論支持，為臨床應(yīng)用提供優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

普通級(jí)健康4個(gè)月齡雌性新西蘭大耳白兔6只，平均體質(zhì)量4 kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。

1.2 主要試劑和儀器

油紅O染液、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶(美國(guó)SIGMA公司)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(武漢碧云天生物技術(shù)研究所)；酶標(biāo)儀(美國(guó)THEROMO公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔ADSCs的分離提取、培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 于兔臀部肌肉注射麻醉藥后，在其頸背部行縱行切口，顯露皮下脂肪，剪碎脂肪組織至糜狀。將分離提取的ADSCs，接種于培養(yǎng)皿中，以1∶3傳代，每2 d換液并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分組: 將體外培養(yǎng)的ADSCs分成3組。A組：第5代ADSCs；B組：第10代ADSCs；C組：第15代ADSCs。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.2 ADSCs的多向誘導(dǎo)分化 成脂和成骨誘導(dǎo)組：當(dāng)?shù)?代的細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合后，分別更換成脂誘導(dǎo)液和成骨誘導(dǎo)液。成脂誘導(dǎo)3周，油紅O染色鑒定其成脂分化能力[7]。成骨誘導(dǎo)4周，茜素紅染色鑒定其成骨分化能力。成脂和成骨對(duì)照組：均常規(guī)培養(yǎng)[7]。

1.3.3 不同代數(shù)組ADSCs的成骨誘導(dǎo)分化 取第5、10、15代細(xì)胞，分別以相同密度接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合后，更換成骨誘導(dǎo)液。分別于成骨誘導(dǎo)的第1、2、3、4周，行茜素紅染色及茜素紅半定量分析[8]。

1.3.4 不同代數(shù)組ADSCs的衰老檢測(cè) 取第5、10、15代的細(xì)胞，按照β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，分別檢測(cè)不同代數(shù)組細(xì)胞的衰老程度，并隨機(jī)選出500個(gè)細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算被染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即為衰老細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察兔ADSCs的形態(tài)特征

ADSCs培養(yǎng)24 h后，鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)且呈寬大成纖維樣，原代細(xì)胞培養(yǎng)至7 d左右，細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，形態(tài)呈均一的長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)(圖1)。

2.2 ADSCs的多向誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo)組：細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液的作用下形成脂肪空泡，空泡被油紅O染成紅色(圖2)。成骨誘導(dǎo)組：細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液的作用下形成礦化結(jié)節(jié)，礦化結(jié)節(jié)被茜素紅染成橘紅色。成脂和成骨對(duì)照組：無(wú)脂肪空泡及礦化結(jié)節(jié)形成。

2.3 不同代數(shù)組ADSCs的成骨誘導(dǎo)分化

茜素紅染色：第5代的ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周，便可出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，當(dāng)成骨誘導(dǎo)至第4周時(shí)，隨傳代次數(shù)的增加，形成的礦化結(jié)節(jié)不僅數(shù)量逐漸減少，且體積相應(yīng)變小，其中第5代細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量最多，體積最大(圖3)。

茜素紅半定量分析：成骨誘導(dǎo)第1周時(shí)，第5、10、15代細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；誘導(dǎo)至第2周，第5代成骨誘導(dǎo)組的鈣鹽沉積量大于第10、15代誘導(dǎo)組，而第10代和第15代之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；誘導(dǎo)至第3、4周，兩兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.4 不同代數(shù)組ADSCs的衰老檢測(cè)

隨體外連續(xù)傳代，細(xì)胞由典型的長(zhǎng)梭形發(fā)展成不規(guī)則形態(tài)，體積變大、變扁，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒，細(xì)胞碎片增多，經(jīng)β-半乳糖苷酶染色，衰老的細(xì)胞被染成藍(lán)色。隨傳代次數(shù)的增加，被染色的衰老細(xì)胞增多(圖5)，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞衰老率升高(圖6)。

3 討論

ADSCs在組織工程的研究中越來(lái)越受到重視，若想成為理想的種子細(xì)胞，需要在保持其多向分化能力的情況下，經(jīng)過(guò)體外的擴(kuò)增培養(yǎng)，以供實(shí)驗(yàn)及臨床需要[5-6]。Zuk等[10]認(rèn)為，第15代之前的ADSCs，仍能保持其多向分化能力。Kang等[11]則持不同觀點(diǎn)，認(rèn)為12代之后的ADSCs其多向分化能力是逐漸下降的。而Wall等[12]卻通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，10代之內(nèi)的ADSCs在傳代的后期其成骨分化能力開(kāi)始逐漸增強(qiáng) 。目前，關(guān)于體外擴(kuò)增培養(yǎng)是否會(huì)對(duì)干細(xì)胞的成骨分化能力產(chǎn)生影響，并未達(dá)成共識(shí)[10-15]。本實(shí)驗(yàn)從分子水平上研究體外擴(kuò)增培養(yǎng)即長(zhǎng)期傳代對(duì)ADSCs成骨分化能力的影響，并且進(jìn)一步探究細(xì)胞衰老與成骨分化能力之間可能存在的關(guān)系。

在成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，不同代數(shù)組的細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后，剛開(kāi)始產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的時(shí)間不同。第5代的ADSCs出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)的時(shí)間最早，成骨誘導(dǎo)2周就可有礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，而第15代的細(xì)胞在誘導(dǎo)至第3周時(shí)才于細(xì)胞密集區(qū)看到少量的礦化結(jié)節(jié)。在相同的誘導(dǎo)時(shí)間下，隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸減少，且體積相應(yīng)變小。茜素紅半定量檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積，成骨誘導(dǎo)1周后，第5、10、15代的ADSCs細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，當(dāng)誘導(dǎo)至第2周，第5代成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞的鈣鹽沉積量大于第10、15代誘導(dǎo)組，而第10代和第15代之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。誘導(dǎo)至第3、4周，兩兩組間比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染色實(shí)驗(yàn)結(jié)合定量分析的結(jié)果表明，隨著傳代次數(shù)的增加，ADSCs成骨分化的能力減弱。學(xué)者們認(rèn)為，體外擴(kuò)增易導(dǎo)致細(xì)胞分子水平發(fā)生變化，而這種變化引起細(xì)胞增殖和分化能力的降低[16]。

圖1 兔ADSCs的形態(tài)(倒置顯微鏡 ×100) a.原代ADSCs培養(yǎng)第7天 b.第3代ADSCs培養(yǎng)第5天圖2 成脂誘導(dǎo)3周油紅O染色結(jié)果(倒置顯微鏡 ×200) a.成脂誘導(dǎo)組形成的脂肪空泡(→) b.脂肪空泡被油紅O染色圖3 成骨誘導(dǎo)4周茜素紅染色結(jié)果(倒置顯微鏡 ×100) a.第5代組 b.第10代組 c.第15代組圖4 茜素紅半定量檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積圖5 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老(→，倒置顯微鏡 ×100) a.第5代組 b.第10代組 c.第15代組圖6 兔ADSCs衰老率檢測(cè)*P<0.05，**P<0.01 第15代：第5代；ΔΔP<0.01 第15代：第10代

Fig1 Morphologies of rabbit ADSCs (Inverted microscope ×100) a. ADSCs of primary culture at 7 days. b. ADSCs of the third passage at 5 days.Fig2 Results of oil red O staining after adipogenic induction at 3 weeks (Inverted microscope，×200) a. formation of lipid vesicles in the adipogenic induction group (→). b. lipid vesicles stained by oil red O.Fig3 Results of alizarin red staining after osteogenic induction at 4 weeks (Inverted microscope ×100) a. the 5th passage group. b. the 10th passage group. c. the 15th passage group.Fig4 Extracellular matrix calcium mineralization detected by semiquantitative analysis of alizarin red.Fig5 Cell senescence detected by β-galactosidase stain (Inverted microscope ×100). a. the 5th passage group. b. the 10th passage group. c. the 15th passage group.Fig6 Detection of rabbit adipose-derived stem cells senescent rate.*P<0.05，**P<0.01 the 15th passage∶ the 5th passage；ΔΔP<0.01 the 15th passage∶ the 10th passage.

在細(xì)胞衰老的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，隨著體外傳代擴(kuò)增，細(xì)胞的形態(tài)由典型的長(zhǎng)梭形發(fā)展成大而扁平的不規(guī)則形態(tài)，相同視野下被β-半乳糖苷酶染色的衰老細(xì)胞所占的比例逐漸升高，說(shuō)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代，兔ADSCs發(fā)生衰老的程度增強(qiáng)。探究細(xì)胞發(fā)生衰老的原因，學(xué)者們認(rèn)為，主要和端粒長(zhǎng)度、氧化應(yīng)激和一些衰老相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[17]。因此，衰老相關(guān)基因的高表達(dá)，可能在細(xì)胞的體外復(fù)制衰老中起到不可忽視的作用。

一項(xiàng)最新的研究結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生衰老的過(guò)程不僅影響獲得細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)也改變它們自我更新和多向分化的能力[18]。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived stem cells, BMSCs)的研究中學(xué)者們發(fā)現(xiàn),衰老的BMSCs其成骨和成脂的分化能力均是降低的[19-21]。隨后，研究者們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，正是由于基因表達(dá)的改變，才導(dǎo)致了衰老BMSCs的分化能力發(fā)生變化[22]。雖然ADSCs與BMSCs具有相似的生物學(xué)特性，但是目前關(guān)于衰老ADSCs多向分化能力的研究卻鮮有報(bào)道。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨體外細(xì)胞大量傳代擴(kuò)增，兔脂肪干細(xì)胞成骨分化的能力下降，發(fā)生衰老的程度加大，但ADSCs成骨分化能力的下降與細(xì)胞復(fù)制衰老之間的相關(guān)性及機(jī)制有待我們更深入地研究。

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Effectofamplifiablecultivationinvitroonsenescenceandosteogenesisofrabbitadipose-derivedstemcells

ZHANGTian-yuan,GUOShu,YUYan-qiu,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,FirstAffiliatedHospitalofChineseMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

ObjectiveTo study the effect of amplifiable cultivation in vitro on senescence and osteogenesis of rabbit adipose-derived stem cells.MethodsRabbit adipose-derived stem cells were isolated from rabbits. The 5th, 10th and 15th passage of cells were harvested for the Alizarin red stained and β-galactosidase stained to compare the osteogenesis and cell senescence among different passage cells, respectively.ResultsThose cells of early passages had mineralized nodules earlier, which the nodules were the most and largest than the late passages cells. The extracellular matrix calcium mineralization decreased and the senescent cells accounted for an increasing proportion with the increase of cell passages，and the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionWith the amplification in vitro, the abilities to induce osteogenic differentiation are reduced and the degree of senescence increase in the rabbit adipose-derived stem cells.

Adipose-derived stem cells; Amplification; Senescence; Osteogenesis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51272286),遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20102296)

110001 遼寧 沈陽(yáng),中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科(張?zhí)戽?，?澍，王晨超，孫 強(qiáng))；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室(于艷秋)

張?zhí)戽?1985-),女,黑龍江齊齊哈爾人,碩士研究生.

郭 澍,110001,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科,電子信箱:guoshu67@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.016

R-322;R318

A

1673-7040(2014)08-0492-04

2014-05-10)