茜素紅“開關(guān)式”熒光探針測定水中微量銅

呂雅娟，史欣榮，李志英

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，山西 汾陽 032200；2.忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000)

銅是一種廣泛存在于環(huán)境中的常見金屬,人體內(nèi)的適量銅離子有利于維持機體的正常運行，若體內(nèi)銅代謝不平衡會給人帶來疾病[1].近年來，工業(yè)的快速發(fā)展引起了環(huán)境水質(zhì)不同程度的污染，尤其是重金屬離子對生活飲用水的污染，嚴(yán)重威脅到人類的生命健康[2]，因此，尋求一種靈敏、快捷、高效的重金屬檢測方法具有非常重要的意義.銅為重金屬之一，目前，用于水環(huán)境中銅污染物檢測的方法有電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[3]、共振光散射法[4]、原子吸收光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]、絡(luò)合滴定法[7]、電化學(xué)分析法[8]、催化動力學(xué)光度法[9]、溶出伏安法[10]、熒光檢測法[11]，熒光檢測法由于其具有靈敏度高、選擇性較好等優(yōu)點受到了國內(nèi)外研究者的青睞.茜素紅(alizarin red,AR)是眾多染料中具有代表性的染料之一，屬于蒽醌類化合物，被廣泛用于染料、酸堿指示劑，能與許多金屬離子生成紅色絡(luò)合物[12]，但茜素紅與金屬離子作用生成熒光物質(zhì)鮮見報道，本實驗通過對不同金屬離子在不同的pH下與茜素紅生成熒光物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，pH=5.2時，茜素紅-鋁絡(luò)合生成發(fā)射橙黃色熒光的絡(luò)合物，Cu2+得電子能力大于Al3+，所以Cu2+與茜素紅絡(luò)合的穩(wěn)定常數(shù)大于Al3+與茜素紅絡(luò)合的穩(wěn)定常數(shù)[13]，但是，Cu2+和Al3+所帶電荷和得電子能力不同，導(dǎo)致它們與茜素紅生成的絡(luò)合物共軛作用和空間結(jié)構(gòu)不同，因此，Cu2+的加入猝滅了茜素紅-鋁絡(luò)合物的熒光，且熒光強度隨著Cu2+濃度的增加降低，由此建立開關(guān)式測定水中微量銅的新方法，該方法具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津RF-5301PC熒光分光光度計；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；AL204 電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；茜素紅(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)：準(zhǔn)確稱取1.401 1 g茜素紅，用少量蒸餾水溶解后定容到100 mL容量瓶中，得4×10-2mol/L儲備液，用時稀釋為4×10-4mol/L的工作液；Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1.703 8 g Cu(NO3)2固體，用少量蒸餾水溶解后定容到100 mL容量瓶中，得1×10-2mol/L Cu(NO3)2儲備液，用時稀釋為1×10-4mol/L的工作液.本實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水.水樣來自云中河河水.

1.2 實驗方法

1.2.1 茜素紅與金屬離子作用的方法

取2支25 mL的比色管，均加入4×10-4mol/L的茜素紅溶液1 mL，醋酸緩沖溶液3 mL,其中一支加入1×10-4mol/L的金屬離子溶液2 mL，用HCl和NaOH調(diào)pH，2支均定容到25 mL.在室溫下反應(yīng)10 min后用1 cm的熒光比色皿在469 nm激發(fā)波長下測定585 nm波長處的熒光強度.

1.2.2 茜素紅-鋁測定Cu2+的方法

取2支25 mL比色管，均依次加入4×10-4mol/L茜素紅溶液1 mL，1×10-4mol/L Al(NO3)3溶液6 mL,其中一支加入1×10-4mol/L銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，另一支不加.加水定容至25 mL，置于30 ℃水浴鍋中加熱10 min，流水冷卻3 min，用1 cm的熒光比色皿于469 nm激發(fā)波長下測定585 nm處的熒光強度，茜素紅-鋁-銅體系熒光強度(F)和茜素紅-鋁體系的熒光強度(F0)，并計算ΔF的值(ΔF=F0-F).

2 結(jié)果與討論

2.1 茜素紅和金屬離子的作用

為了研究茜素紅與12種金屬離子的熒光光譜，按1.2.1的方法，固定其他條件不變，加入12種金屬離子，只改變各溶液的pH依次為4、5、6、7，測量溶液的熒光強度.結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知，不同pH下，茜素紅和金屬離子作用的熒光光譜不同，研究發(fā)現(xiàn)茜素紅能與許多金屬離子絡(luò)合，但是pH不同各種離子的絡(luò)合能力不同，并且在pH=4～7時只有Al3+、Pb2+、Zn2+和茜素紅絡(luò)合物發(fā)出熒光，而在pH=5時茜素紅能與過量的Al3+離子結(jié)合，生成強熒光絡(luò)合物，Pb2+、Zn2+形成的絡(luò)合物熒光較弱，與其他金屬作用的生成物幾乎沒有熒光.

圖1 不同pH條件下茜素紅與不同金屬離子作用的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of alizarin red interacting with different metal ions at different pH

2.2 茜素紅和Al3+作用的熒光光譜

為了研究茜素紅及茜素紅加鋁離子的熒光光譜，按1.2.1的方法，固定其他條件不變，配制加入Al3+與不加Al3+的溶液，只改變各溶液的pH依次為4、5、6、7、8，測量溶液的熒光強度.結(jié)果如圖2和圖3所示.

圖2 茜素紅與鋁作用熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of alizarin red with Al3+

圖3 茜素紅的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of alizarin red

由圖2和圖3可知茜素紅在pH=4、5、6時，在558 nm處有弱熒光，加入Al3+在585 nm處發(fā)出較強的熒光，當(dāng)pH=7、8時在630 nm處有熒光，加入Al3+熒光強度基本不變，可以說明pH對茜素紅絡(luò)合Al3+影響較大.

2.3 茜素紅-鋁與Cu2+作用的熒光光譜

取25 mL的比色管，分別加入4×10-4mol/L的茜素紅溶液1 mL，溶液呈黃色，依次加入5×10-5mol/L的硝酸鋁溶液0、2、4、8、10、12 mL，溶液由黃色變成橘黃色，然后加水定容.按1.2.2的方法測量溶液的熒光強度.結(jié)果如圖4所示.

按實驗1.2.2的方法，分別配制茜素紅、茜素紅-Al(NO3)3、茜素紅-Al(NO3)3-Cu(NO3)2，在激發(fā)波長469 nm和發(fā)射波長585 nm處測量溶液的熒光強度.結(jié)果如圖5所示.

圖4 鋁離子和茜素紅作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of aluminum ion and alizarin red

圖5 銅離子對茜素紅-鋁的熒光猝滅光譜Fig.5 Fluorescence quenching spectra of copper to aluminum and alizarin red complex

由圖4可知：茜素紅在559有較弱的熒光，Al3+的加入使吸收峰紅移至585 nm處，且隨著Al3+濃度增加，熒光強度增強，過量的Al3+和茜素紅形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,但加入濃度更大的Al3+熒光強度升高較小，且已經(jīng)超過本儀器檢測的范圍(1 000).這種方法可以選擇測定一定濃度的Al3+，但線性范圍較小，檢出限高，所以不做研究，本實驗用4×10-4mol/L的茜素紅溶液1 mL加入1×10-4mol/L的Al(NO3)3溶液6 mL為熒光探針，二者濃度比為2∶3.

由圖5可知Cu2+通過更強的絡(luò)合能力與茜素紅結(jié)合，使Al3+游離出來，熒光強度隨著Cu2+濃度的增加而降低，可以選擇此反應(yīng)體系測定Cu2+.

2.4 反應(yīng)pH及緩沖溶液用量的選擇

按1.2.2的實驗方法，固定其他條件不變，用HCl和NaOH調(diào)pH=3～8，測定溶液的熒光強度，并計算ΔF的值(ΔF=F0-F)，如圖6所示.圖6結(jié)果表明在堿性環(huán)境下，585 nm處的熒光強度很弱，體系的顏色也發(fā)生變化.在酸性條件下熒光強度隨著pH的增大先增大后減小，在pH=5時ΔF最大，用酸度計確定pH=5.2.配制pH=5.2的HAc-NaAc緩沖溶液，測定緩沖溶液的最佳用量，結(jié)果如圖7.由圖7可知，緩沖溶液最佳用量為3 mL.

圖6 pH對反應(yīng)體系ΔF的影響Fig.6 Effect of pH on reaction system ΔF

圖7 HAc-NaAc緩沖溶液的用量Fig.7 Amount of HAc-NaAc buffer solution

2.5 反應(yīng)溫度和時間的選擇

按1.2.2的實驗方法，固定其他條件不變，只改變反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70 ℃，測定溶液的熒光強度，并計算ΔF的值(圖8)；固定其他條件不變，只改變反應(yīng)時間為5、10、15、20、25、30 min，測定溶液的熒光強度，并計算ΔF的值(圖9).

圖8 溫度對反應(yīng)體系ΔF的影響Fig.8 Effect of temperature on reaction system ΔF

圖9 時間對反應(yīng)體系ΔF的影響Fig.9 Effect of time on reaction system ΔF

圖8表明，隨著溫度的升高ΔF先增大后減小，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，ΔF最大，之后隨著溫度的升高而降低，故選30 ℃為最佳反應(yīng)溫度.圖9表明，隨著時間的增加ΔF先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)時間為10 min時，ΔF最大，反應(yīng)最佳.

2.6 工作曲線及檢出限

配制一系列不同濃度的Cu2+溶液，按實驗方法分別進(jìn)行熒光光譜掃描，結(jié)果見圖10、圖11.結(jié)果表明：Cu2+濃度在0.2～30 μmol/L時與ΔF呈良好的線性關(guān)系.其線性回歸方程為ΔF=19.7c+101.2，R2=0.999 5.對5 μmol/L的Cu2+溶液，平行測定6個樣品，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10.將空白溶液平行測定11次，用公式3S/K求得檢出限為0.022 μmol/L.

圖10 不同濃度的Cu2+猝滅的熒光光譜Fig.10 Fluorescence spectra of Cu2+ quenched complexes with different concentrations

圖11 工作曲線Fig.11 Work curve

2.7 干擾離子的影響

2.8 樣品分析

分別取2種水樣，再加入適量六偏磷酸鈉除去水中鐵離子，最后用少量活性炭除去水中其他少量雜質(zhì)并過濾.取濾液2 mL置于25 mL比色管，按1.2.2的實驗方法配制溶液，測定熒光強度ΔF.結(jié)果如表1.

表1 樣品及回收率的測定(n=6)

由表1可知，實際樣品測定回收率為99.3%～101%.取同樣的自來水，用原子吸收法和熒光猝滅法進(jìn)行測定，結(jié)果分別為(1.26±0.021)μmol/L和(1.25±0.012)μmol/L.兩者比較，經(jīng)t檢驗，兩者無統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)論

本文在pH=5.2下，Cu2+可以猝滅Al3+與茜素紅絡(luò)合物的熒光，建立了一種“開關(guān)式”測定Cu2+的新方法，此方法測定Cu2+的工作曲線為ΔF=19.7c+101.2，R2= 0.999 5,線性為0.2～30 μmol/L，檢出限0.022 μmol/L.與國標(biāo)原子吸收光譜法比較沒有顯著性差異，該方法具有靈敏度高、背景值低、操作簡單、方便等優(yōu)勢，能更好地適用于水質(zhì)監(jiān)測，與其他方法相比更先進(jìn)，更有應(yīng)用價值.