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    新靶點CyclinE干擾RNA對人腦膠質(zhì)瘤侵襲能力的影響

    2014-10-27 16:54:37呼格吉樂高乃康韓艷秋
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年26期
    關(guān)鍵詞:侵襲

    呼格吉樂 高乃康 韓艷秋

    [摘要] 目的 構(gòu)建人CyclinE新靶點的干擾RNA真核表達(dá)載體,觀察CyclinE表達(dá)受抑制后的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力的變化。 方法 構(gòu)建4個新靶點CyclinE干擾RNA的真核表達(dá)載體后,用雙酶切和堿基序列測定,轉(zhuǎn)染載體到膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株,將其分為U251組、PNC-U251組、PCyclinE-1-U251組、PCyclinE-2-U251組、PCyclinE-3-U251組、PCyclinE-4-U251組。通過RT-PCR的結(jié)果檢測各組CyclinE mRNA的表達(dá)量,將干擾效果最好的一組用Transwell小室法檢測侵襲能力的變化。 結(jié)果 成功構(gòu)建了新靶點CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4,而且CyclinE mRNA表達(dá)受到抑制,其中PCyclinE-1-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(45.4±2.7)個,U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(75.2±2.9)個和(74.4±3.5)個,U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t = 1.23,P = 0.31),PCyclinE-1-U251組和U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t = 15.00,P = 0.00),PCyclinE-1-U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t = 13.81,P = 0.00)。 結(jié)論 本實驗構(gòu)建了新靶點CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體,PCyclinE-1-U251細(xì)胞侵襲能力減弱。

    [關(guān)鍵詞] 干擾RNA;細(xì)胞周期蛋白E;侵襲

    [中圖分類號] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2014)09(b)-0009-04

    人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的腫瘤之一,但是由于其侵襲性能力強(qiáng),增殖速率快,導(dǎo)致預(yù)后極差[1]。尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,惡性程度最高,但是其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確,而且沒有像甲胎蛋白、人附睪蛋白、前列腺特異性抗原等常用且有效的腫瘤標(biāo)志物[2-3]。正常的人腦膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的最大區(qū)別就在于許多和細(xì)胞周期調(diào)控的基因發(fā)生了改變,細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)就是其中之一。CyclinE在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá),與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶2(cyclin-dependent kinase,CDK2)結(jié)合促進(jìn)pRB的磷酸化,并且和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子家族的基因結(jié)合在一起形成復(fù)合物,促進(jìn)細(xì)胞周期從G1到S進(jìn)程繼續(xù)下去。CyclinE過量表達(dá)會使G1期縮短,導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入S期的時間提前,干擾細(xì)胞核核酸復(fù)制和分裂,導(dǎo)致腫瘤的形成[4-5]。因此,研究CyclinE表達(dá)的下調(diào)顯得非常有意義,每個基因都不是單獨(dú)存在并且發(fā)揮作用的,CyclinE也不例外其表達(dá)的下調(diào)會影響哪些基因的表達(dá)和功能還有待醫(yī)學(xué)工作者去研究。干擾RNA技術(shù)能夠特異的使基因沉默,近年已經(jīng)作為一個常規(guī)實驗應(yīng)用于腫瘤基因?qū)W研究的多個領(lǐng)域。本研究利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計并構(gòu)建了新的CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體,采用雙酶切和堿基序列測定的方法鑒定Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建的4個載體到膠質(zhì)瘤細(xì)胞,通過檢測轉(zhuǎn)染后CyclinE mRNA表達(dá)量,篩選出沉默效果最好的一個載體,為后續(xù)在CyclinE沉默后用雙向電泳技術(shù)研究蛋白質(zhì)組學(xué)的變化以及用基因芯片技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄水平變化奠定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫,DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶購自MBI公司,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海英駿公司,DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖等購自北京天根生化科技有限公司,Transwell小室購自Corning公司。

    1.2 方法

    1.2.1 實驗分組

    本實驗將沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的組定為U251組;將轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的組設(shè)為PNC-U251組;將轉(zhuǎn)染PCyclinE-1質(zhì)粒的組設(shè)為PCyclinE-1-U251組;將轉(zhuǎn)染PCyclinE-2質(zhì)粒的組設(shè)為PCyclinE-2-U251組;將轉(zhuǎn)染PCyclinE-3質(zhì)粒的組定為PCyclinE-3-U251組;將轉(zhuǎn)染PCyclinE-4質(zhì)粒的組定為PCyclinE-4-U251組。

    1.2.2 新靶點CyclinE干擾RNA的構(gòu)建

    1.2.2.1干擾載體的靶序列 4對siRNA的靶序列即干擾部位為:PCyclinE-1:5'-GGATGGTTCCATTTGCCATGG-3';PCyclinE-2:5'-GCTTCGGCCTTGTATCAT TTC-3';PCyclinE-3:5'-GCCAGCCTTGGGACAATAA TG-3';PCyclinE-4:5'-GCCCTTAAGTGGCGTTTAAG T-3'。同時設(shè)立陰性對照(NC)。

    1.2.2.2 干擾載體的檢驗 把所提取的質(zhì)粒用BamHⅠ,PstⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。正確的重組載體不會被PstⅠ切開但是會被BamHⅠ切開。酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒用堿基序列測定方法鑒定載體構(gòu)建成功與否。

    1.2.3 干擾質(zhì)粒對U251細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

    按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,把經(jīng)過鑒定正確的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合后分別加入人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中混合培養(yǎng),48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。

    1.2.4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組CyclinE mRNA表達(dá)

    提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),CyclinE上游引物為5'-ACCAGTTTGCGTATGTGAC-3',下游引物為5'-CTGCTCTGCTTCTTACCG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為583 bp。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物為5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3',下游引物為5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為300 bp。每組設(shè)3個平行樣本,即每組的PCR產(chǎn)物分別平行的加到3塊1.5%瓊脂糖膠上分離,用凝膠分析軟件分析條帶光密度。CyclinE平均光密度值(IDV)與GAPDH的IDV比值(IDVCyclinE/IDVGAPDH)即為CyclinE mRNA的相對表達(dá)量,本實驗以U251組的CyclinE mRNA的相對表達(dá)量為“1”,計算各組的干擾效率=[1-(每組的CyclinE mRNA的相對表達(dá)量)/(U251組CyclinE mRNA的相對表達(dá)量)]×100%。

    1.2.5 Transwell小室法侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力

    把Transwell小室按照操作說明書制備好后,細(xì)胞計數(shù)調(diào)整至5×105個/mL。在Transwell小室的上室中加入含2×105個細(xì)胞的培養(yǎng)基400 μL,培養(yǎng)箱中放置12 h。吸去上室的液體,再用濕棉簽擦去半透膜表面的細(xì)胞,常規(guī)HE染色或吉姆薩-瑞氏雙染。每組設(shè)3個平行樣本,每張膜計數(shù)5個視野,取細(xì)胞數(shù)的平均值,然后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 19.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 酶切和測序結(jié)果

    雙酶切檢測和堿基序列測定結(jié)果表明,所有的CyclinE真核表達(dá)載體以及陰性對照載體均與所設(shè)計的序列完全相同,并且沒有發(fā)現(xiàn)任何異常。見圖1。

    2.2 CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果

    于轉(zhuǎn)染24 h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞,除U251組外其他各組均有綠色熒光蛋白表達(dá)。

    2.3 轉(zhuǎn)染干擾RNA真核表達(dá)載體后CyclinE mRNA水平

    結(jié)果顯示,PCyclinE-1-U251組的干擾效率最高,達(dá)到77%,因而后續(xù)的侵襲實驗采用該組作為實驗組。見表1、圖2。

    2.4 轉(zhuǎn)染CyclinE干擾RNA對U251細(xì)胞侵移能力的影響

    計數(shù)每個200倍視野下的12 h穿膜細(xì)胞數(shù),PCyclinE-1-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(45.4±2.7)個,U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(75.2±2.9)、(74.4±3.5)個,U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.23,P=0.31),PCyclinE-1-U251組和U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.00,P=0.00),PCyclinE-1-U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.81,P=0.00)。

    3 討論

    RNA干擾的原理是21~25 bp的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)通過和Dicer酶等復(fù)合物的一系列作用使得同源序列mRNA發(fā)生降解[6]。干擾RNA技術(shù)能夠特異的使基因沉默,近年已經(jīng)作為一個常用的手段應(yīng)用于研究腫瘤的基因的多個領(lǐng)域:新抗腫瘤藥中的研究[7];腫瘤細(xì)胞中基因的改變引起侵襲能力、生長速率、細(xì)胞凋亡水平變化、組蛋白甲基化等的研究[8-10];腫瘤早期發(fā)生發(fā)展時異常變化[11]相關(guān)研究。介導(dǎo)siRNA的載體主要有化學(xué)合成的小片段、質(zhì)粒和慢病毒3種,化學(xué)合成的小片段廉價但是轉(zhuǎn)染效率低而且只適合瞬時轉(zhuǎn)染;慢病毒介導(dǎo)載體適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,能夠使得目的基因整合到基因組中[12],但是有一定的危險性,不適合一般的實驗室使用,所以本研究選用了質(zhì)粒作為介導(dǎo)的載體,既可以做瞬時轉(zhuǎn)染也適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且安全性高。

    有研究表明,CyclinE過量表達(dá)會使會使得G1期縮短,導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入S期的時間提前,干擾細(xì)胞核核酸的復(fù)制和分裂,和骨肉瘤、卵巢癌、鼻咽癌、宮頸癌等腫瘤的侵襲有密切的關(guān)系,是導(dǎo)致腫瘤的形成原因之一[13-16]。但是在關(guān)于CyclinE在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和作用少有報道。因此本實驗就CyclinE在膠質(zhì)瘤的侵襲中的作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)CyclinE被干擾后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力減弱。

    膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生、發(fā)展不是某一個基因的作用,如P27蛋白在細(xì)胞中可以降解CyclinE-CDK2復(fù)合物從而抑制細(xì)胞的增殖和分裂[17]。E2F蛋白、錨 蛋 白Ankrd17可以促進(jìn)CyclinE基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。因此CyclinE不是單獨(dú)存在并且發(fā)揮作用的,它表達(dá)的下調(diào)會影響許多基因的表達(dá)和細(xì)胞的一系列功能。這些基因有可能在膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展中起非常重要的作用。所以本實驗利用RNA干擾技術(shù)使得CyclinE沉默,且沉默效果顯著,并使得增殖能力和侵襲能力減弱。除去CyclinE在細(xì)胞周期中的直接作用外,因為CyclinE和CDK2結(jié)合后才能發(fā)揮作用,所以當(dāng)CyclinE沉默后它們的結(jié)合復(fù)合體減少,可能也引起CDK2的表達(dá)減弱,當(dāng)CDK2表達(dá)減弱時也會引起細(xì)胞生長速率降低、侵襲能力降低[19]。當(dāng)然也可能和波形蛋白等許多和腫瘤侵襲、代謝相關(guān)的蛋白共同作用的結(jié)果。這就需要用雙向電泳技術(shù)研究蛋白質(zhì)組學(xué)的變化以及用基因芯片技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄水平變化,而本實驗為后續(xù)的實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。

    綜上所述,當(dāng)本研究干擾RNA的技術(shù)使得CyclinE沉默后,再用雙向電泳及基因芯片技術(shù)來做相應(yīng)的研究就可能發(fā)現(xiàn)一系列有意義的、相關(guān)的差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì),為膠質(zhì)瘤的研究提供有價值的資料。

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    (收稿日期:2014-04-04 本文編輯:任 念)

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    (收稿日期:2014-04-04 本文編輯:任 念)

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    (收稿日期:2014-04-04 本文編輯:任 念)

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