青蒿素抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

錢(qián)斌　李小軍　陳蔚

[摘要] 目的 研究青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響。 方法 培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞株并用含有不同劑量青蒿素的無(wú)血清DMEM進(jìn)行干預(yù)，分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組，以不含青蒿素的無(wú)血清DMEM作為對(duì)照組。干預(yù)后48 h時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的增殖活力、侵襲數(shù)目及增殖基因、侵襲基因的mRNA表達(dá)量。 結(jié)果 處理后48 h時(shí)，75、150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目以及細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P < 0.05），且青蒿素劑量越大，細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目以及細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量越高（P < 0.05）。 結(jié)論 青蒿素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

[關(guān)鍵詞] 青蒿素；胃癌；增殖；細(xì)胞周期；侵襲

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（a）-0039-04

[Abstract] Objective To study the effect of artemisinin on the proliferation and invasion of gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured and dealt with different doses of artemisinin in serum-free DMEM， respectively as 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group， serum-free DMEM without artemisinin as control group. After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and mRNA expression of proliferation gene， invasion gene were determined. Results After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression of 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group were significantly lower than those of control group， TIMP1 and TIMP2 mRNA expression were significantly higher than those of control group （P < 0.05）， and the higher the dose of artemisinin， the lower the cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression， the higher the TIMP1 and TIMP2 mRNA expression （P < 0.05）. Conclusion Artemisinin can inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells by inhibiting the expression of cell cycle proteins and matrix metalloproteinases.

[Key words] Artemisinin； Gastric cancer； Proliferation； Cell cycle； Invasion

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來(lái)的發(fā)病率呈逐步升高趨勢(shì)。目前，胃癌的早期診斷率較低，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期且錯(cuò)過(guò)了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)?；熓侵型砥谖赴┑闹饕委熓侄?，但在化療過(guò)程中胃癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性并影響化療效果、造成化療失敗[1-2]。因此，尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。青蒿素是從中藥材青蒿中分離得到的有效成分，臨床上主要用于瘧疾的治療。近年來(lái)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素具有廣泛的抗癌活性，對(duì)膀胱癌[3]、宮頸癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用。但是，青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響尚不明確。本研究分析了青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購(gòu)買(mǎi)于Hyclone公司（批號(hào)2016C0482），青蒿素購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司（批號(hào)2016C215），MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Promega公司（批號(hào)2016-394），RNA抽提試劑盒（批號(hào)E2016-24）、cDNA第一鏈合成試劑盒（批號(hào)F2016-039）、熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)A2016-77）購(gòu)買(mǎi)于上?？禐槭兰o(jì)公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 SGC-7901細(xì)胞株復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度，每2天更換1次培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%～90%后用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，消化后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中并用于后續(xù)處理。

1.2.2 細(xì)胞處理方法 培養(yǎng)板中的細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%后，棄去培養(yǎng)基并用不含血清的DMEM清洗2遍，而后加入含有不同劑量青蒿素的無(wú)血清DMEM進(jìn)行干預(yù)，分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組，以不含青蒿素的無(wú)血清DMEM作為對(duì)照組。處理后48 h進(jìn)行細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目及基因表達(dá)的檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)方法 用于細(xì)胞增殖活力檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在96孔細(xì)胞板中，不同條件處理48 h后，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL MTS試劑盒的檢測(cè)液，而后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱、繼續(xù)孵育3～4 h；待培養(yǎng)基變色后，將培養(yǎng)板放置在多功能酶標(biāo)儀上，測(cè)定450 nm處的吸光度值并以該吸光度值作為細(xì)胞的增殖活力值。

1.2.4 細(xì)胞侵襲數(shù)目的檢測(cè)方法 用于細(xì)胞侵襲數(shù)目檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在Transwell小室內(nèi)，不同條件處理48 h后取出小室，PBS洗2遍后去下小室底部的濾膜，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察濾膜，隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野并對(duì)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，而后計(jì)算平均值，并以該平均值作為細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.2.5 細(xì)胞中基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)方法 用于基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在12孔細(xì)胞板中，不同條件處理48 h后，棄去培養(yǎng)基并用PBS洗2遍，而后使用RNA抽提試劑盒分離細(xì)胞中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的基因包括Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、β-actin，擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性3 min后95℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72℃ 20 s重復(fù)45個(gè)循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算上述基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件錄入并分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間計(jì)量資料比較采用方差分析，對(duì)方差分析有差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD-t兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素處理后的細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目

處理后48 h時(shí)，75、150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 青蒿素處理后細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)量

處理后48 h時(shí)，75、150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量顯著低于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 青蒿素處理后細(xì)胞中侵襲基因的表達(dá)量

處理后48 h時(shí)，75、150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）；150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量顯著低于150 μmol/L青蒿素組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

中晚期胃癌目前尚缺乏有效的靶向治療藥物，常規(guī)化療容易產(chǎn)生耐藥性并影響化療效果[6-7]。因此，尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。青蒿素是從中藥材青蒿中提取得到的具有抗瘧疾作用的活性成分。近年來(lái)關(guān)于青蒿素的藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等衍生物，其中以雙氫青蒿素的作用最為廣泛，具有廣泛的抗癌特性，能夠殺傷癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖[8-10]。相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí)，青蒿素對(duì)膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用。目前，關(guān)于青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響尚不明確。在本研究中，為了明確青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，首先對(duì)不同劑量青蒿素處理后胃癌細(xì)胞的增殖活力和侵襲數(shù)目進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：不同劑量青蒿素組的細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目均顯著低于對(duì)照組，且青蒿素劑量越大，細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目越低。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性的趨勢(shì)。

胃癌細(xì)胞的增殖是造成胃癌病灶生長(zhǎng)、體積增大的重要病理環(huán)節(jié)，細(xì)胞周期進(jìn)程的加速與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。CyclinD1是目前研究較為廣泛的細(xì)胞周期蛋白，主要作用于細(xì)胞周期G/S期的轉(zhuǎn)換并發(fā)揮正性調(diào)控作用[11-12]。CyclinD1與CDK4、CDK6形成復(fù)合體后能夠引起pRb發(fā)生磷酸化并釋放E2F，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周G1期進(jìn)入S期。細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期的加速能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。Ki-67是在細(xì)胞增殖細(xì)胞核中特異性表達(dá)的分子，能夠識(shí)別細(xì)胞周期中核抗原上的決定簇，Ki-67的表達(dá)量能夠反映細(xì)胞周期進(jìn)展的速度以及細(xì)胞增殖的活力[14-15]。本研究通過(guò)分析不同劑量青蒿素處理對(duì)胃癌細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)不同劑量青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，且青蒿素劑量越大，細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量越低。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性的趨勢(shì)。

胃癌細(xì)胞的侵襲是造成胃癌病灶向臨近組織浸潤(rùn)、向遠(yuǎn)處組織浸潤(rùn)的重要病理環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜的降解與細(xì)胞的侵襲密切相關(guān)。MMPs是目前已知對(duì)多種蛋白質(zhì)具有降解作用的一族鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶。MMPs家族中的MMP2和MMP9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜中的膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等多種成分具有降解作用，是細(xì)胞中重要的促侵襲基因[16-17]。胃癌病灶中高表達(dá)的MMP2和MMP9能夠通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜中的多種成分來(lái)促進(jìn)細(xì)胞侵襲[18-19]。在局部組織中，MMP2和MMP9的活性受到TIMP1和TIMP2的抑制，TIMP1和TIMP2也是細(xì)胞中重要的侵襲抑制基因[20]。本研究通過(guò)分析不同劑量青蒿素處理對(duì)胃癌細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)不同劑量青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且青蒿素劑量越大，細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量越高。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞中促侵襲基因的表達(dá)具有抑制作用，對(duì)侵襲抑制基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用，且該調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴(lài)性。

綜上所述，青蒿素能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制細(xì)胞周期蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，是青蒿素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。

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（收稿日期：2017-02-27 本文編輯：張瑜杰）