高效液相色譜法測定上清丸中大黃酸大黃素大黃酚的含量

廖楊玲

【摘要】目的：建立以HPLC法測定上清丸中大黃酸、大黃素、大黃酚含量的方法。方法：采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.1%磷酸=80:20為流動相，檢測波長：430nm，流速1.0mL?min-1，柱溫:室溫。結(jié)果：大黃酸、大黃素、大黃酚分別在7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.7%、99.2%、99.4%，RSD分別為0.95%、1.25%、1.27%。結(jié)論：本方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于上清丸中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量測定。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；上清丸； 大黃酸、大黃素、大黃酚

【Abstract】Objective: To establish a HPLC for determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing Pills. Method: A Symmetry C18 Column was used. The mobile phase was methanol-0.1% Phosphoric Acid =80:20， the detecting wavelength was at 430nm，the flow rate was 1.0mL?min-1，the column temperature was room temperature. Result: The linear relationship of rhein、emodin、chrysophanol were 7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）, the recoveries were 99.7%, 99.2%, and 99.4%,respectively, the RSD were 0.95%, 1.25%, and 1.27%,respectively. Conclusion: This method was easy and simple to handle, has good repeatability, flexibility and high sensitivity. It can be used for the determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing pills.

【key words 】HPLC; Shangqing pills; rhein; emodin; chrysophanol

【中圖分類號】R927.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0007-01

上清丸由菊花、白芷、黃芩、黃柏等12味藥而制成的大蜜丸，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊》，具有清熱散風(fēng)、解毒、通便等功效，對頭暈耳鳴、目赤、鼻竇炎、通便等有很好的作用［1］。目前的標(biāo)準(zhǔn)中只有丸劑的通則檢查，尚無定性定量指標(biāo)，而目前的文獻(xiàn)報(bào)道主要對其方中的大黃、黃柏進(jìn)行定性鑒別［2］，或者對黃芩苷［2］、小檗堿［3］進(jìn)行含量控制，但為了有效控制質(zhì)量，我們認(rèn)為控制方中主藥大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚的含量更有意義。我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)［4－9］并改進(jìn)，采用高效液相色譜法測定上清丸中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.儀器與試藥

美國Waters高效液相色譜儀（1525二元泵，2487雙通道檢測器，717自動進(jìn)樣器，Empower色譜工作站）；色譜柱：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）。SG3300HP超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）； KQ3000超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；WX-80A微型旋渦混合儀（上海滬西儀器有限公司）；BT25S電子天平（精度0.01mg，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FA1104電子天平（精度0.1mg，上海舜宇恒平儀器有限公司）。

大黃酸對照品（批號：0757-200206）、大黃素對照品（批號：110756-200110）、大黃酚對照品（批號：110796-200412）均購自中國藥品生物制品檢定所，均為供含量測定用。上清丸產(chǎn)自湖南XX制藥股份有限公司（批號：20120906、20121101、20130305，規(guī)格：9克?丸－1）；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水；其他試劑為分析純。

2、方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜條件：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm），流動相：甲醇－0.1%磷酸=80:20；流速：1.0mL?min-1；檢測波長：430nm；柱溫: 室溫；進(jìn)樣量:10μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的大黃酸、大黃素、大黃酚對照品4.46、8.25、13.62 mg，分別置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取大黃酸、大黃素、大黃酚對照品儲備液各1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含大黃酸、大黃素、大黃酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取本品20丸，剪碎，取約3g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，冷卻，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取5ml，置錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)?.5mol/L硫酸溶液10 mL，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）5min，再加三氯甲烷10mL，置水浴上加熱回流1h，立即冷卻，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液的制備取缺大黃陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果大黃酸、大黃素、大黃酚與鄰峰基線分離，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)不低于7000，且其他成分不干擾其測定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

A.混合對照品，B.樣品，C.陰性樣品，1.大黃酸，2.大黃素，3.大黃酚

2.4線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品混合溶液2.0、4.0、6.0、10.0、16.0、20.0μl分別注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱座標(biāo)，以進(jìn)樣量（C）為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，大黃酸回歸方程為A=3.218×104 C－2.682×103， r=0.9998（n＝6），在7.92～79.2ng呈良好的線性關(guān)系；大黃素回歸方程為A=2.878×104C－3.042×103，r=0.9991（n＝6），在14.5～145ng呈良好的線性關(guān)系；大黃酚回歸方程為A=3.588×104 C－1.042×104，r=0.9994（n＝6），在27.24～272.4ng呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取對照品混合溶液在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，每次進(jìn)樣10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積的RSD值分別為1.2%、0.8%、0.6%。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號20120906的供試品溶液，分別于0、1、3、5、10h分別進(jìn)樣測定，結(jié)果5次進(jìn)樣大黃酸峰面積的RSD=1.4%；大黃素峰面積的RSD=0.9%；大黃酚峰面積的RSD=1.2%，結(jié)果表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取批號20120906的樣品，按“2.2.2”供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法測定，大黃酸平均含量為0.2948mg/g，RSD=0.8%；大黃素平均含量為0.4015 mg/g，RSD=1.1%；大黃酚平均含量為0.6700 mg/g，RSD=1.2%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性好。

2.8回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：20120906，含大黃酸、大黃素、大黃酚分別為0.2948、0.4015、0.6700mg?g-1），剪碎，取約1.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，冷卻，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取5mL，分別精密加入混合對照品溶液（含大黃酸、大黃素、大黃酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1）8.0、10.0、12.0mL各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下，自“蒸干，殘?jiān)?.5mol/L硫酸溶液10 mL”起，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測定含量，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

Tab 1ResultofDetermination of sample recovery (n=3)

2.9樣品的測定

取供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，測定3批樣品，結(jié)果見表2

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

Tab 2ResultofDetermination of rhein、emodin、chrysophanol (n=3)

批號 含量(mg/g) 大黃酸 大黃素 大黃酚20120906 0.2948 0.4015 0.670020121101 0.3102 0.4528 0.732820130305 0.3148 0.4600 0.72823 討論

3.1測定波長的選擇

分別取三種對照品溶液，于200nm～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果三種對照品均在254、285、430nm處有最大吸收，選擇254nm作為測定波長，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)在此波長處吸收很強(qiáng)，干擾主成分的測定，而在430nm處雜質(zhì)吸收弱，雜質(zhì)干擾小，有利于樣品中有效成分的測定，故選定430nm作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的選擇［4］

試驗(yàn)曾選用三氯甲烷和乙醚對樣品進(jìn)行提取，三氯甲烷提取的大黃酸、大黃素和大黃酚的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙醚，故選用三氯甲烷作為提取溶劑。提取2次和提取3次含量無明顯差別，故選擇提取2次。

3.3回流時(shí)間的的考察［5］

為保證樣品中樣品的結(jié)合蒽醌能完全水解為游離蒽醌，用2.5mol/L硫酸溶液對樣品的結(jié)合總蒽醌進(jìn)行加熱水解，試驗(yàn)了3個(gè)不同的水解時(shí)間，第一份加熱水解0.5h、第二份加熱水解1.0h、第三份加熱水解1.5h，按上述擬定的供試品溶液制備方法及含量測定項(xiàng)下的條件，依法測定。結(jié)果表明，回流提取0.5小時(shí)，樣品中的大黃素水解不完全，回流提取1.0、1.5h，均可使樣品中的大黃素水解完全，因此確定加入2.5mol/L的硫酸溶液10mL與三氯甲烷10ml回流提取時(shí)間為1.0h。

3.4 流動相的選擇

比較了甲醇與0.1%磷酸的多種不同配比，結(jié)果甲醇：0.1%磷酸=80:20，出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形好，且大黃酸、大黃素、大黃酚與鄰峰基線分離好。

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