華蟾素對乳腺癌MCF-7移植瘤裸鼠的抗腫瘤作用及機(jī)制研究

薛 瑞，張青松，張玉潔，曹軍華

0 引言

乳腺癌是全球第二高發(fā)的惡性腫瘤，特別是在歐美國家，為女性中發(fā)病率最高的癌癥。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率也逐年增高，目前臨床上主要以手術(shù)和化療為治療手段［1］?；熢谌橄侔┲委熤姓加兄匾牡匚唬淙狈x擇性，損傷機(jī)體，影響機(jī)體的免疫功能。華蟾素注射液主要成分是蟾毒靈和吲哚生物堿等，為干蟾皮的水化萃取物，對多種人腫瘤細(xì)胞都具有抑制作用，因安全有效、毒副作用小而被廣泛應(yīng)用于臨床［2］，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究觀察華蟾素體內(nèi)對MCF-7荷瘤裸鼠腫瘤生長及免疫功能的影響，探討其抗乳腺癌作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供;SPF級BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物繁殖中心，按SPF級要求管理;華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司);順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);MTT和胰蛋白酶(Sigma公司);ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司);CO2孵箱(JOUAN公司);FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國 BD公司產(chǎn)品);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠荷瘤模型的建立及分組 裸鼠飼養(yǎng)在26～28℃、40% ～60%的濕度環(huán)境中，全部實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)過程達(dá)到SPF條件。MCF-7細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×107/mL，于裸鼠右前肢腋背部皮下接種0.2 mL。接種成功的裸鼠隨機(jī)分為5組:模型組、順鉑(25 mg/kg)陽性對照組、華蟾素(25、50、100 mg/kg)3個劑量組，每組10只。另設(shè)正常對照組。正常組和模型組每日用生理鹽水灌胃，順鉑和華蟾素組采用腹腔注射方式給藥，每次0.2 mL，皆連續(xù)給藥12 d。

1.2.2 血常規(guī)及肝、腎功能的檢測 末次給藥后24 h，對裸鼠稱重，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使肝素化后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血檢測血常規(guī)中白細(xì)胞(leukocyte，Leu)、血紅蛋白(haemoglobin，Hb)和血小板(platalet，Plt)的濃度;一部分離心分離出血漿檢測肝功能中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和腎功能中血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)的濃度。

1.2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 裸鼠血清用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記抗CD4+和CD8+抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌2次，1%的多聚甲醛400 μL固定，流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 抑瘤率的檢測 取血后斷髓處死裸鼠，剝瘤，稱重。計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100%。

1.2.5 臟器指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞增殖的檢測 剝瘤的同時取胸腺、脾臟，稱重，計算胸腺、脾臟指數(shù)。取脾臟并制成細(xì)胞懸液。用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL。在37℃、5 CO2條件下刀豆蛋白(5 μg/mL)作用72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心，棄上清，每孔加入異丙醇200 μL，室溫振蕩，在酶標(biāo)儀上550 nm處檢測A值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以±s來表示，配對組間比較采用樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 對荷瘤裸鼠血常規(guī)、肝腎功能的影響 給藥12 d后，順鉑組荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)為(8.14±1.30)×109/L，與模型組(12.52±2.15)×109/L相比明顯降低(P＜0.01);而華蟾素3個給藥組血常規(guī)、肝腎功能的檢測結(jié)果與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具體結(jié)果見表1。

表1 荷瘤裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能和體重檢測結(jié)果(±s，n=10)

表1 荷瘤裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能和體重檢測結(jié)果(±s，n=10)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.01

組別 白細(xì)胞(×109/L)血紅蛋白(g/L)血小板(×109/L)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(U/L)血尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)模型組 12.52±2.15 114.76±4.87 1 109.4±120.1 61.29±6.30 50.2±2.71 7.43±2.41 67.04±9.26順鉑組 8.14±1.30* 108.15±11.41 1 053.2±98.5 63.02±7.41 57.7±6.25 7.24±0.49 63.14±8.03華蟾素(25 mg/kg) 10.47±1.49 119.66±8.16 1 069.3±126.4 59.13±7.25 54.2±7.85 6.78±1.03 59.23±5.35華蟾素(50 mg/kg) 11.13±2.01 121.17±6.15 1 063.5±121.2 65.34±8.01 59.2±4.83 6.04±1.42 62.16±8.07華蟾素(100 mg/kg) 11.59±2.21 118.46±4.36 1 074.4±119.7 60.32±7.41 50.3±5.63 7.14±2.03 63.12±9.95

2.2 對荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，華蟾素能夠改善荷瘤裸鼠CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)目的異常，提高 CD4+/CD8+比值。其中高劑量組與荷瘤對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

2.3 對荷瘤裸鼠移植瘤生長抑制作用 與模型組比較，順鉑(25 mg/kg)和華蟾素3個劑量(25、50、100 mg/kg)腹腔注射給藥皆可明顯抑制荷瘤裸鼠的瘤質(zhì)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);隨著華蟾素劑量的增加，抑瘤率增高，見表3。

2.4 對裸鼠臟器指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖的影響華蟾素對荷瘤裸鼠的脾臟增大沒有拮抗作用，而對胸腺增大有抑制作用，高劑量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。模型組裸鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著下降，華蟾素能夠劑量依賴性地促進(jìn)其增殖，高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表4。

表2 華蟾素對荷瘤裸鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s，n=10)

表2 華蟾素對荷瘤裸鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05

組別 劑量(mg/kg)CD4+/CD3+(%)CD8+/CD3+(%)CD4+/CD8+(%)正常組- 75.09±2.56 19.61±2.54 3.86±0.36模型組 - 63.47±2.65## 27.54±3.33# 2.31±0.28##順鉑組 25 68.41±2.85 24.96±2.18 2.74±0.60華蟾素 25 68.66±4.78 25.07±2.68 2.73±0.45華蟾素 50 68.90±4.18 24.77±2.12 2.78±0.29華蟾素 100 70.37±2.97* 21.38±3.34 3.30±0.31*

表3 華蟾素對荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的影響(±s，n=10)

表3 華蟾素對荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.001

組別 劑量(mg/kg) 瘤質(zhì)量(g) 抑瘤率(%)模型組-1.878±0.513 -順鉑組 25 0.923±0.042* 50.86華蟾素 25 1.214±0.100* 35.39華蟾素 50 1.082±0.206* 42.40華蟾素 100 0.978±0.113*47.95

表4 華蟾素對荷瘤裸鼠免疫指標(biāo)的影響(±s，n=10)

表4 華蟾素對荷瘤裸鼠免疫指標(biāo)的影響(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù) 淋轉(zhuǎn)刺激指數(shù)- 5.33±0.18 5.55±0.20 3.12±0.13模型組 - 7.62±0.73##7.04±0.75#2.03±0.27##順鉑組 25 7.76±0.18 6.16±1.44 2.11±0.41華蟾素 25 6.78±0.14 5.32±1.3 2.05±0.32華蟾素 50 7.04±0.16 4.76±1.86 2.37±0.42華蟾素 100 7.11±0.19 4.04±1.02*2.83±0.23正常組＊＊

3 討論

華蟾素注射液是大蟾蜍皮經(jīng)加工制成的水溶性制劑，具有清熱解毒、利水消腫、化癖潰堅等作用，現(xiàn)在臨床上用于多種惡性腫瘤的治療［3-5］。本研究發(fā)現(xiàn)，3個劑量的華蟾素均可抑制乳腺癌模型裸鼠腫瘤的生長，提示其體內(nèi)具有抗乳腺癌活性。而通常藥物濃度超過一定范圍會有毒副作用，一般表現(xiàn)在對消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及肝腎功能的影響上。本研究觀察給藥期間裸鼠的一般狀況，華蟾素給藥的三組裸鼠均未見有消瘦、厭食、活躍程度下降等異常;血常規(guī)及肝腎功能檢測結(jié)果和模型組比較也均無顯著差異(P＞0.05)，提示在本給藥劑量下，華蟾素可選擇性抑制MCF-7細(xì)胞的生長，而對正常血細(xì)胞和肝、腎器官無明顯毒副作用。相比之下，順鉑組荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)明顯低于陰性對照組(P＜0.05)，可能與順鉑有一定的骨髓抑制性有關(guān)。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能紊亂密切相關(guān)。免疫功能較低者，惡性腫瘤發(fā)生率增高;而腫瘤進(jìn)行性生長時又會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能進(jìn)一步受損［6-7］。T淋巴細(xì)胞浸潤程度可反映機(jī)體的抗腫瘤狀態(tài)。成熟T細(xì)胞按細(xì)胞膜分子表型不同，可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，二者細(xì)胞膜上均有CD3抗原，對免疫功能的影響相反。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能低下時，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性的CD4+細(xì)胞比例減少，具有免疫抑制功能和細(xì)胞毒作用的CD8+細(xì)胞比例增多［8-9］。本結(jié)果顯示，模型組小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖顯著下降，華蟾素能夠劑量依賴性地促進(jìn)其增殖，并提高荷瘤裸鼠CD4+/CD8+比值，高劑量組效果更為顯著，提示其可通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群而改善細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。

調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能是腫瘤綜合治療的重要環(huán)節(jié)，也是評價腫瘤輔助治療的重要指標(biāo)。華蟾素既有一定的抑瘤作用，又可提高荷瘤裸鼠的免疫功能，還有其他的抗腫瘤作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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