ACE2對(duì)大鼠心肌梗死后心肌重構(gòu)的影響

崔貞玉，韓素霞 ，董曉光，馮 磊，常建梅，郭李平

0 引言

心肌梗死后大量心肌細(xì)胞的肥大、死亡和纖維細(xì)胞的生成導(dǎo)致心肌重塑的形成，包括早期的梗塞膨脹、非梗死區(qū)反應(yīng)性肥厚和晚期球形心室擴(kuò)張［1-2］。心肌重塑能導(dǎo)致左室擴(kuò)張、心功能異常與死亡，嚴(yán)重?fù)p害了心梗后的心功能。因此如何預(yù)防和減輕心肌梗死后的心肌重塑成為臨床醫(yī)師迫切解決的問(wèn)題。心肌梗死后的心肌重塑與RAS系統(tǒng)的激活相關(guān)［3］。有研究表明，心肌梗死不僅能激活循環(huán)RAS，其心肌梗死模型組心肌AngⅡ表達(dá)量亦明顯高于假手術(shù)組組，提示心肌梗死同時(shí)導(dǎo)致了心肌局部RAS系統(tǒng)的激活［4］。眾所周知，RAS系統(tǒng)中起著升壓、損害心功能等的關(guān)鍵作用因子是AngⅡ［5-6］。而 ACE2自2000年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其主要的生物學(xué)效應(yīng)就是降解AngⅡ生成Ang1-7［7］。Ang-(1-7)作用于其受體 MAS，有降低血壓、減輕心肌纖維化等拮抗 AngⅡ的作用［8-9］。因此我們推測(cè)，ACE2對(duì)調(diào)節(jié)心肌梗死后的心肌重塑的作用也非常關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 (200±20)g雄性SD大鼠32只(購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，SPF級(jí)。倫審號(hào):IACUC-20121127010)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MI組、MI+氯沙坦小劑量組和MI+氯沙坦大劑量組，每組各8只。術(shù)前禁食12 h。腹腔內(nèi)麻醉后固定，記錄心電圖。經(jīng)口腔行氣管插管，接呼吸機(jī)。無(wú)菌條件下消毒切口，在左側(cè)2、3肋間開(kāi)胸，于左心耳右下緣1 mm、肺動(dòng)脈圓錐左緣處用6號(hào)帶針縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，心電圖顯示QRS波增寬增高及不同肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬0.2 mV以上，肉眼下觀察結(jié)扎后梗死區(qū)變蒼白，則提示結(jié)扎成功。結(jié)扎成功后關(guān)胸。假手術(shù)組在心臟相應(yīng)部位掛線，但不結(jié)扎。術(shù)后24 h內(nèi)給予嗎啡肌注鎮(zhèn)痛，6 h/1次;術(shù)后3 d連續(xù)給予青霉素肌注預(yù)防感染，1次/d。于術(shù)后24 h開(kāi)始灌胃給藥，給藥期1個(gè)月。假手術(shù)組和MI組給予蒸餾水等量灌胃，MI+氯沙坦小劑量組給予替米沙坦10 mg/(kg·d)，MI+氯沙坦大劑量組給予替米沙坦20 mg/(kg·d)。

1.2 取材 將大鼠腹腔內(nèi)麻醉后腹主動(dòng)脈放血致死，在心臟還未停止跳動(dòng)時(shí)快速取下心尖部心臟，將組織縱剖為二，分別置于液氮和4%多聚甲醛中保存。

1.3 心肌組織病理學(xué)觀察 組織于4%多聚甲醛中固定，24 h換一次液，48 h后石蠟包埋切片，按蘇木素-伊紅(HE)染色程序染色，光鏡下觀察心肌組織梗死后心肌細(xì)胞腫脹、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.4 定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 用Trizol試劑盒(roche公司，瑞士)按說(shuō)明書(shū)抽提心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(roche公司，瑞士)將1 μg RNA按其說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)，由上海生工公司合成并純化，ACE2引物:上游5'-GTGGAGCACTGACTGGAGC-3'，下 游 5'-GACAGGAGGCTCGTAAGGTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng):403 bp;AngⅡ 引物:上游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'， 下 游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng):244 bp;MAS引物:上游 5'-TGACAGCCATCAGTGTGGAGA-3'，下游5'-GCATGAAAGTGCCCACAGGA-3'，擴(kuò) 增 片 段長(zhǎng)度:116;β-actin引物:上游 5'-CCCTGTGCTGCTCACCGA-3'，下游 5'-ACAGTGTGGGTGACCCCGTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度:186 bp。MAS和 βactin的反應(yīng)體系為40 μL，AngⅡ和ACE2的反應(yīng)體系為25 μL。目的基因的擴(kuò)增條件:95℃下預(yù)變性5 min后，95℃變性30 s，最適退火溫度30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。其中MAS、AngⅡ、ACE2的退火溫度分別為59.5、60、55℃。β-actin的退火溫度 57 ℃。取 5 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠85 V電泳30 min。凝膠用全能型凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司，美國(guó))攝像，錄入計(jì)算機(jī)，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶的面積和平均灰度，計(jì)算樣本的灰度值(面積×平均灰度)，以各組β-actin灰度值為內(nèi)參照，計(jì)算各指標(biāo)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量(相對(duì)灰度%)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel軟件及SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間差異采用方差分析。多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECG結(jié)果 結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支前，心電圖顯示為正常心電圖，心率145次/min;結(jié)扎后心電圖結(jié)果顯示:心率202次/min，ST段抬高，T波高尖，為典型心肌梗死心電圖波形，提示心肌梗死模型建造成功。見(jiàn)圖1。

2.2 病理形態(tài)觀察 HE染色顯示MI組梗死區(qū)心肌細(xì)胞腫脹、變形、破裂、排列雜亂，細(xì)胞質(zhì)流入細(xì)胞間隙，幾乎沒(méi)有明顯的殘存心肌細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;氯沙坦大劑量組心肌細(xì)胞壞死少見(jiàn)，細(xì)胞腫脹減輕，心肌纖維排列紊亂，部分肌纖維斷裂，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);氯沙坦小劑量組居中;假手術(shù)組心肌纖維排列規(guī)則，無(wú)病理改變。見(jiàn)圖2。

2.3 RT-PCR結(jié)果

2.3.1 ACE2的RT-PCR結(jié)果 MI組心尖部心肌組織的表達(dá)量高于假手術(shù)組(P＜0.05)。替米沙坦大劑量組和小劑量組的表達(dá)量均高于MI組，且大劑量組升高更顯著(P＜0.05)。

2.3.2 AngⅡ的RT-PCR結(jié)果 MI組心尖部心肌組織的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。替米沙坦大劑量組和小劑量組的表達(dá)量均低于MI組，且大劑量組降低更顯著(P＜0.05)。

圖3 各組大鼠ACE2的RT-PCR電泳結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心尖部梗死區(qū)心肌組織中AngⅡ表達(dá)量明顯增加，氯沙坦組呈劑量依賴性下降。心室重構(gòu)程度跟AngⅡ表達(dá)量呈正相關(guān)。ACE2在MI組變化不明顯或代償性地輕微增加，氯沙坦組呈劑量依賴性繼續(xù)增加。本研究旨在通過(guò)氯沙坦的藥物作用來(lái)使得藥物組ACE2表達(dá)量增加，以便觀察不同劑量ACE2對(duì)AngⅡ表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物組ACE2表達(dá)量越高，AngⅡ表達(dá)量越少，病理染色觀察其心肌細(xì)胞腫脹和壞死也隨之明顯減輕。說(shuō)明ACE2可抑制AngⅡ表達(dá)量，減輕心室重構(gòu)，保護(hù)殘存心功能。

ACE2與Ang-(1-7)及其受體MAS一起組成與傳統(tǒng) ACE-AngⅡ-AT1相拮抗的保護(hù)性 RAS軸:ACE2-Ang-(1-7)-MAS 受體軸［10］。該軸發(fā)揮降壓、抗炎、抗纖維化和抗增殖等重要作用。ACE的同源物ACE2自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就被證實(shí)通過(guò)降解AngⅡ和生成Ang-(1-7)來(lái)發(fā)揮作用，也是心肌組織中 AngⅡ降解和 Ang-(1-7)生成的主要途徑［7-11］。Averill等［12］研究證實(shí)，Ang-(1-7)在心臟的表達(dá)局限在心肌細(xì)胞內(nèi)，梗死的心肌細(xì)胞無(wú)Ang-(1-7)表達(dá)，梗死周邊區(qū)域Ang-(1-7)表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示 Ang-(1-7)與心肌重構(gòu)有關(guān)，而ACE2是降解 AngⅡ生成Ang-(1-7)的關(guān)鍵酶。Gurzu 等［13］發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-7)可抑制 AngⅡ誘導(dǎo)的血管收縮，表明Ang-(1-7)可與AT1受體結(jié)合發(fā)揮作用。心肌梗死后機(jī)體通過(guò)代償機(jī)制上調(diào)ACE2的表達(dá)，既能降解過(guò)度增高的AngⅡ，減輕其對(duì)心肌的毒性作用，又能催化生成對(duì)心肌有保護(hù)作用的Ang-(1-7)，進(jìn)一步拮抗AngⅡ的表達(dá)，抑制和逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，對(duì)衰竭心臟有保護(hù)效應(yīng)［14］，從而對(duì)心肌梗死后受損的心肌產(chǎn)生雙重的保護(hù)作用，延緩心功能惡化。

目前ACE2軸是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究已經(jīng)取得了一定的成果。其中較有意義的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除ACE2基因后的小鼠出現(xiàn)左室變薄、心功能減退等表現(xiàn)，再敲除ACE基因后原本受損的心功能恢復(fù)正常，證實(shí)ACE和ACE2的負(fù)向調(diào)節(jié)作用及其表達(dá)的穩(wěn)態(tài)對(duì)維持正常心功能的重要性［15］。心肌梗死大鼠心肌組織中AngⅡ和ACE2的mRNA表達(dá)量均較假手術(shù)組升高，進(jìn)一步證實(shí)了心肌梗死后心臟局部RAS系統(tǒng)的激活。根據(jù)以往研究推測(cè)MI組ACE2升高是由心肌梗死后慢性長(zhǎng)期的組織修復(fù)導(dǎo)致［16］。其他原因如:血流動(dòng)力學(xué)紊亂、心肌重構(gòu)等慢性刺激因素，具體的機(jī)制尚不清楚。但心肌梗死后心肌組織中ACE2的表達(dá)量增加，ACE/ACE2比值卻升高，表明梗死激活A(yù)CE的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ACE2，ACE2已經(jīng)不能對(duì)抗過(guò)度激活的ACE，大量AngⅡ生成，發(fā)揮其促炎癥、增殖、纖維化等心臟毒性效應(yīng)［17］。

因此我們推測(cè)，AngⅡ在藥物組表達(dá)的減少可能依賴3方面因素:①藥物抑制心肌梗死后AT1受體上調(diào)，阻斷了AngⅡ與其主要作用受體AT1的結(jié)合，進(jìn)一步拮抗了AngⅡ的生成［18］。②ACE2表達(dá)量的增加使AngⅡ降解增加，將其降解為Ang-(1-7)，從而作用于MAS受體發(fā)揮降壓、抗纖維化等保護(hù)作用。③ACE2的增加使AngⅡ的降解產(chǎn)物Ang-(1-7)增加，反作用于AT1受體，拮抗其功能，從而抑制 AngⅡ的表達(dá)［19-20］。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與以往研究結(jié)果基本一致。進(jìn)一步證實(shí)了心肌梗死后RAS系統(tǒng)的激活對(duì)心室重構(gòu)的影響，也明確了ACE2通過(guò)減少AngⅡ的表達(dá)來(lái)抑制心肌梗死后心室重塑的作用機(jī)制，為臨床治療心室重塑提供了更深一步的參考方案，為心肌梗死預(yù)后心功能的改善提供了更多的可能性。

［1］Moran A，Gu D，Zhao D，et a1.Future cardiovascular disease in china:markov model and risk factor sc-enario projcottons from the coronary heart disease policy model-china［J］.Circ Cmdiovasc Qual Outcomes，2010，3(3):243-252.

［2］Kassiri Z，Zhong J，Guo D，et al.Loss of angiotensin-converting enzyme 2 accelerates maladaptive left ventricular remodeling in response to myocardial infarction［J］.Circ Heart Fail，2009，2(5):446-455.

［3］Gavras I，Gavras H.AngiotensinⅡ as a cardiovascular risk factor［J］.J Hypertens，2002，16(2):S2-S6.

［4］Zhao YX，Yin HQ，Yu QT，et al.ACE2 Overexpression improves left ventricular remodeling and funct-ion in rats with myocardial infarction［J］.Hum Gene Ther，2010，96(9):863-874.

［5］Wojewodzka-Zelezniakowicz M，Chabielska E，Mogielnicki A，et al.Antithrombotic effect of tissue and p-lasma type angiotensin converting enzyme inhibitors in experimental thrombosis inrats［J］.J Physiol Pharma，2006，57(2):231-245.

［6］Kramkowski K，Mogielnicki A，Chabielska E，et al.The effect of'tissue'and'plasma'angiotensin converting enzyme inhibitors on overall haemostatic potentials in rats［J］.Thromb Res，2006，117(5):557-561.

［7］Donoghue M，Hsieh F，Baronas E，et al.A novel angiotensin converting enzyme related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensinⅠ to angiotensin-(1-9)［J］.Circ Res，2000，87(5):E1-E9.

［8］Hayashi N，Yamamoto K，Ohishi M，et al.The counterregulating role of ACE2 and ACE2-mediated angi-otensin-(1-7)signaling against angiotensinⅡ stimulation in vascular cells［J］.Hypertens Res，2010，33(11):1182-1185.

［9］Santos RA，Simoes e Silva AC，Maric C，et al.Angiotensin-(1-7)is an endogenous lig-and for the G protein-coupled receptor Mas［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(14):8258-8263.

［10］Santos RA，F(xiàn)erreira AJ，Pinheiro SV，et al.Angiotensin-(1-7)and its receptor as a potential targets for new cardiovascular drugs［J］.Expert Opin Investig Drugs，2005，14(8):1019-1031.

［11］Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-converting enzyme.Cloning and fu-nctionalexpression as a captopril-insensitive carboxypeptidase［J］.J Biol Chem，2000，275(43):33238-33243.

［12］Averill DB，Ishiyama Y，Chappell MC，et al.Cardiac angiotensin-(1-7)in ischemic cardiomyopathy［J］.Circulation，2003，106(17):2141-2146.

［13］Gurzu B，Costuleanu M，Slatineanu SM，et al.Are multiple angiotensin receptor types involved in an-giotensin(1-7)actions on isolated rat portal vein［J］.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2005，6(2):90-95.

［14］Leung PS.The peptide hormone angiotensinⅡ:its new functions in tissues and organs［J］.Curr Protein Pept Sci，2004，5(4):267-273.

［15］Crackower MA，Sarao R，Oudit GY，et al.Angiotensin converting enzyme 2 isan essential regulator of heart function［J］.Nature，2002，417(6891):822-828.

［16］Burrell LM，Risvanis J，Kubota E，et al.Myocardial infarction increases ACE2 expression in rat and hu-mans［J］.Eur Heart J，2005，26(11):369-375.

［17］王江.ACE/ACE2相互負(fù)向調(diào)節(jié)與心力衰竭心肌重構(gòu)的關(guān)系［D］.重慶:第三軍醫(yī)大學(xué)，20070501.

［18］曲秀芬，李晶潔，喜楊，等.犬心肌梗死后血管緊張素受體的異常分布及纈沙坦對(duì)其的調(diào)節(jié)作用［J］.中華心血管雜志，2009，37(4):358-362.

［19］Rice GI，Thomas DA，Grant PJ，et al.Evaluation of angiotensin-converting enzyme(ACE)，its homologue A-CE2 andneprilysin in angiotensin peptide metabolism［J］.Biochem J，2004，383(Pt 1):45-51.

［20］Igase M，Strawn WB，Gallagher PE，et al.Angiotensin II AT1 receptors regulate ACE2 and angiotensin-(1-7)expression in the aorta of spontaneously hypertensive rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(3):H1013-H1019.