絲裂原活化蛋白激酶與核因子-κB在碳酰氯吸入性肺損傷中的作用

邵義如 申捷 袁震 何岱昆

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院化學(xué)傷害醫(yī)療救治中心重癥監(jiān)護(hù)室，上海 201508)

碳酰氯(俗稱(chēng)光氣)作為一種重要的化工原料，全球年產(chǎn)量超過(guò)200萬(wàn)噸。碳酰氯吸入可導(dǎo)致吸入性肺損傷，甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。隨著對(duì)碳酰氯吸入性肺損傷的發(fā)病機(jī)制的研究的深入，將有助于ARDS的早期診斷和特異性治療，對(duì)降低碳酰氯吸入性肺損傷患者的病死率也有重要意義。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素、高氧、燒傷、缺血再灌注及機(jī)械通氣等引起的肺損傷中，活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)使轉(zhuǎn)錄因子如激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等磷酸化，這些轉(zhuǎn)錄因子再作用于靶基因5'端的一些調(diào)控序列(如轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合位點(diǎn)、CAMP反應(yīng)元件等)，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(inerleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素(inerleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(inerleukin-8，IL-8)等炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)過(guò)程，參與肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。MAPKs包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、蛋白激酶p38和c-氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK) 3種通路蛋白。磷酸化的MAPKs(p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)具有活性。前期的研究[3-6]表明，p38、JNK活性蛋白通路在碳酰氯吸入性肺損傷中發(fā)揮作用，本研究旨在探討MAPKs與NF-κB在碳酰氯吸入性肺損傷中的作用及相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 固體碳酰氯(浙江省海寧中聯(lián)化學(xué)有限公司)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF，上海生物工程有限公司)，ERK1/2特異性阻斷劑PD98059、p38特異性阻斷劑SB203580和JNK特異性阻斷劑SP600125(上海碧云天公司)，大鼠NF-κB抗體(上海Santa cruz公司)，Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，考馬斯亮藍(lán)試劑盒(上海鈺森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 40只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～280 g，第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0003，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將40只大鼠隨機(jī)分為空氣對(duì)照組、碳酰氯吸入組、PD98059干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和SP600125干預(yù)組，每組8只?？諝鈱?duì)照組吸入空氣，碳酰氯吸入組與3個(gè)干預(yù)組吸入相同濃度的碳酰氯。3個(gè)干預(yù)組在暴露于碳酰氯前30 min時(shí)給予相應(yīng)的特異性阻斷劑，PD98059(0.4 mg/100 g)腹腔內(nèi)注射，SB203580(25 μg/100 g)靜脈注射，SP600125(30 μg/100 g)皮下注射?？諝鈱?duì)照組和碳酰氯吸入組給予等量0.9%氯化鈉液，藥物配制及用藥劑量參照文獻(xiàn)[6]。

1.3 碳酰氯吸入性肺損傷模型的制備及標(biāo)本的采集 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。應(yīng)用德國(guó)拜耳健康醫(yī)療研究中心提供的定向流動(dòng)碳酰氯吸入裝置，制備大鼠碳酰氯吸入性肺損傷模型，給予8.33 mg/L的碳酰氯吸入(純度為100%)，染毒時(shí)間5 min。大鼠腹腔內(nèi)注射20%烏拉坦麻醉后，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，肺動(dòng)脈插管后即灌注0.5 mL含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，以去除血管內(nèi)容物和血漿，取部分肺組織分別行冰凍切片、甲醛固定，其余肺組織投入液氮快速冷凍后-80 ℃保存，以備后續(xù)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目

1.4.1 肺組織病理學(xué)檢查 取右上葉肺組織，制備切片后HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.4.2 肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)二步法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，一抗(NF-κB抗體)稀釋比例為1∶100，二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)稀釋比例為1∶1000，二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染。在顯微鏡下觀察，胞核和(或)胞漿呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)胞為NF-κB陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。

1.4.3 肺組織中NF-κB p65蛋白含量的檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)，用 Quantity one軟件分析蛋白條帶，內(nèi)參照采用3-磷酸甘油脫氫酶(3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，蛋白含量采用目的條帶校正容積/GAPDH校正容積表示。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織的病理變化 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空氣對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡隔無(wú)水腫、炎性反應(yīng)等改變；碳酰氯吸入組出現(xiàn)明顯肺損傷，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔、血管旁和支氣管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)有大量滲出物和透明膜形成，并可見(jiàn)肺間質(zhì)出血和水腫。應(yīng)用MAPKs特異拮抗劑預(yù)處理后，除PD98059干預(yù)組外，SB203580干預(yù)組、SP600125干預(yù)組的肺水腫明顯減輕，肺泡腔滲出物及炎性細(xì)胞量減少，但其病理改變?nèi)暂^空氣對(duì)照組重，見(jiàn)圖1。

2.2 肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)的變化 免疫組織化學(xué)染色顯示，空氣對(duì)照組肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞見(jiàn)少量NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，碳酰氯吸入組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞較多，廣泛分布于肺內(nèi)多種細(xì)胞中，包括肺泡上皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、胸膜間皮細(xì)胞、浸潤(rùn)炎細(xì)胞及間質(zhì)纖維細(xì)胞，且細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)增多；而SB203580干預(yù)組、SP600125干預(yù)組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，PD98059干預(yù)組NF-κB變化不明顯，見(jiàn)圖2。

A：空氣對(duì)照組；B：碳酰氯吸入組；C：PD98059干預(yù)組；D：SB203580干預(yù)組；E：SP600125干預(yù)組

A：空氣對(duì)照組；B：碳酰氯吸入組；C：PD98059干預(yù)組；D：SB203580干預(yù)組；E：SP600125干預(yù)組

2.3 肺組織NF-κB p65蛋白含量的變化 Western blotting結(jié)果顯示，碳酰氯吸入組NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平較空氣對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SB203580干預(yù)組、SP600125干預(yù)組的NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平均低于碳酰氯吸入組(P<0.05)。PD98059干預(yù)組NF-κB p65蛋白表達(dá)量與碳酰氯吸入組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

1: 空氣對(duì)照組；2：碳酰氯吸入組；3：PD98059干預(yù)組；4：SB203580干預(yù)組；5：SP600125干預(yù)組

表1 各組肺組織中NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

MAPKs是多種信息傳遞途徑的交匯點(diǎn)和共同通路，在細(xì)胞分化、存活、死亡以及機(jī)體炎性反應(yīng)中有重要作用。前期研究[5-6]表明，碳酰氯吸入所致的肺損傷過(guò)程中，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活；應(yīng)用特異性阻斷劑干預(yù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JNK、p38通路參與了肺損傷。

NF-κB是近年研究較多的一個(gè)促炎因子，其在炎性反應(yīng)的發(fā)生及調(diào)節(jié)中起重要作用[7]。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，碳酰氯吸入組肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于空氣對(duì)照組；而p38、JNK的特異性阻斷劑SB203580、SP600125干預(yù)后NF-κB蛋白表達(dá)均低于碳酰氯吸入組，即NF-κB蛋白的表達(dá)增減趨勢(shì)與p-JNK、p-p38一致；提示在碳酰氯吸入性肺損傷中，JNK和p38可通過(guò)調(diào)控NF-κB蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作用。

本研究中HE染色結(jié)果顯示，與空氣對(duì)照組比較，碳酰氯吸入組肺損傷程度嚴(yán)重，而特異性阻斷劑SP600125和SB203580干預(yù)后肺損傷明顯好轉(zhuǎn)；Western blotting結(jié)果顯示，NF-κB蛋白表達(dá)水平變化與肺損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)并受JNK和p38信號(hào)蛋白的調(diào)控。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，在碳酰氯吸入性肺損傷中，MAPKs的激活主要是通過(guò)p38、JNK信號(hào)通路的活化，調(diào)控NF-κB蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，這是碳酰氯吸入性肺損傷發(fā)病機(jī)制之一，與其他因素所致肺損傷的研究結(jié)果一致。

綜上所述，碳酰氯吸入性肺損傷中，JNK、p38通路可通過(guò)調(diào)控NF-κB的表達(dá)而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，而NF-κB對(duì)JNK、p38通路是否存在反饋調(diào)節(jié)作用，有待進(jìn)一步研究。

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[4]He DK,Shao YR,Zhang L,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin 1 suppresses NF-κB and p38 MAPK and attenuates inflammatory responses in phosgene-induced acute lung injury[J].Inhal Toxicol,2014,26(3):185-192.

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