非小細胞肺癌組織miRNA-221表達及其與預后的關系研究

呂俊杰 徐磊 許有濤 邱滿堂 楊欣 王潔 尹榮 許林

微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是一類長度為20個-24個核苷酸的小的內源性非編碼調控RNA，通過靶向結合mRNA的3'非翻譯區(qū)（3′-UTR）導致mRNA的降解或翻譯抑制[1,2]，從而調控靶基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學進程。腫瘤的發(fā)展涉及多種基因在轉錄及轉錄后、翻譯及翻譯后等進程，而這些進程受到不同的因子調控[3]。miRNA就是其中一類重要的調控因子[4]，通過調節(jié)關鍵的癌基因或抑癌因子，miRNAs與腫瘤的發(fā)生、進展等密切相關[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNAs約有700多種，miRNA-221是其中一個重要的miRNA分子。研究[6]表明miRNA-221在包括肺癌在內的多種腫瘤中表達明顯上調，提示miRNA-221可能是一種潛在的致癌miRNA。近年來，研究者對于miRNA-221在促進腫瘤細胞增殖遷移等方面研究相對廣泛，然而其在肺癌預后方面的研究很少。本研究回顧性分析江蘇省腫瘤醫(yī)院117例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的臨床資料，并對上述患者肺癌組織標本進行miRNA-221表達檢測，分析生存期與該基因表達之間的關系，試圖探討miRNA-221作為NSCLC預后分子標志的可能性。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集江蘇省腫瘤醫(yī)院2005年11月-2007年1月期間手術切除并經(jīng)病理確診為NSCLC的石蠟標本117例。所有患者術前均未接受過放化療。肺癌病理分型及分期標準按照1992年UICC-AJCC（Union for International Cancer Control-American Joint Committee on Cancer）對NSCLC的診斷標準執(zhí)行。所有患者都簽署了知情同意書。本研究經(jīng)江蘇省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器 高速冷凍離心機；NanoDropND-1000紫外分光度計（NanoDrop）；7300 Real-time PCR System(Applied Biosystems公司)、9700 Thermocycler反應儀； Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit（Applied Biosystems公司）；has-miRNA-221引物、內參RNU6B引物（RiboBio公司）；Real-time逆轉錄試劑盒（RR037A）（TakaRa公司）；SYBR? Select Master Mix試劑盒（Applied Biosystems公司）。

1.3 實時定量PCR方法

1.3.1 蠟塊組織總RNA提取 利用Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit（Applied Biosystem）試劑盒提取肺癌石蠟組織總RNA, 嚴格遵照說明書進行各操作步驟?？俁NA用50 μL DEPC水稀釋，儲存于-80 °C備用。采用NanoDropND-1000紫外分光度計測量總RNA OD260/280。

1.3.2 逆轉錄反應 按照逆轉錄試劑盒操作程序進行逆轉錄反應，RNA的量為0.5 μg，冰上加入下列試劑：總RNA 1 μL，5×PrimeScript Buffer 5 mL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，stem-loop RT primer 2 μL，DEPC水，總體積20 μL。所有試劑加入后，42 °C反應15 min、85 °C 5 s、4 °C 15 min，后置-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時定量PCR 實時定量PCR反應體系如下：SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上游引物（5 μM）1 μL，下游引物（5 μM）1 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至20 μL。將反應管置7300 Real-time PCR反應儀（Applied Biosystem）中，反應條件為95 °C預變性 10 min后，按下述條件擴增40個循環(huán)：95 °C 15 s，60 °C 1 min。實驗重復三次。

1.4 隨訪 所有117例患者進行電話和書信形式隨訪，了解生存情況等信息，隨訪截止日期為2011年3月，中位隨訪時間40個月（范圍3個月-64個月）。

1.5 統(tǒng)計學方法 MiRNA-221相對表達量采用2-△△Ct方法[7]，△△Ct = △Ct - Avg.△Ct = (CtmiRNA-221 - CtU6) -Avg.(CtmiRNA-221 - CtU6)。把2-△△Ct中位數(shù)作為分界值，將患者分為miRNA-221低表達組和高表達組。MiRNA-221表達與臨床病理學參數(shù)統(tǒng)計方法采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，并采用Log-rank檢驗比較兩組生存率；采用Cox風險比例模型進行各個協(xié)變量的聯(lián)合效應分析。應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基本資料 在117例NSCLC患者中，男性86例，女31例。中位年齡60歲（范圍：41歲-79歲）。病理證實為腺癌72例，鱗癌45例。病理分期I期41例，II期-IIIa期76例。其中44例無吸煙史，73例有吸煙史。具體見表1。

2.2 miRNA-221表達與NSCLC患者臨床資料關系 根據(jù)miRNA-221的表達，肺癌患者被相對分為miRNA-211高表達和低表達組。117例NSCLC組織中，59例miR-211相對高表達。統(tǒng)計結果顯示，miRNA-221的表達量與患者年齡（χ2=4.547, P=0.033）相關。其中60歲以上肺癌患者組織中有25例miRNA-221呈高表達，36例低表達；60歲以下患者中，miRNA-221呈高表達34例，低表達22例。miRNA-221的表達量與性別（χ2=0.070, P=0.791）、病理類型（χ2=0.414, P=0.520）、p-TNM分期（χ2=0.068,P=0.794）及吸煙史（χ2=0.206, P=0.650）均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 miRNA-221表達與NSCLC患者生存時間的關系 利用Kaplan-Meier對117例患者進行生存分析，結果顯示：miR-211高表達組患者中位生存時間35.34個月，較miRNA-221低表達組患者（平均48.72個月）明顯縮短，兩組生存期差異有統(tǒng)計學意義（Log-rank檢驗：P=0.006）（圖1）。Cox風險比例模型單因素分析顯示：肺癌p-TNM分期偏晚（P=0.003）和miR-211高表達（P=0.007）與NSCLC患者預后相關（表2）。 根據(jù)Cox回歸模型多因素分析的結果，p-TNM分期偏晚（P=0.004）和miR-211高表達（P=0.005）是NSCLC患者預后的獨立危險因素（表2）。

3 討論

NSCLC主要包括腺癌和鱗狀細胞癌，約占據(jù)全球因癌癥死亡患者的1/6[8]。盡管在臨床與實驗腫瘤學方面均取得很多進展，但肺癌的預后仍然不佳，5年總體生存率大約11%[9]。因此，了解詳細的機制對于診斷、預防和治療NSCLC是必不可少的。最近，越來越多的證據(jù)[10]表明，miRNAs參與NSCLC的發(fā)病機制；miRNAs可作為一項工具來調控與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的信號通路和一些關鍵基因或因子，與腫瘤分化、發(fā)生、侵潤和轉移等多個環(huán)節(jié)密切相關。而miRNA-221是miRNAs大家族的重要一員，位于人類X染色體p11.3。文獻表明miRNA-221在腦膠質瘤[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、乳腺癌[13]、肝細胞癌[14]、前列腺癌[15]和卵巢癌[16]等多種癌癥中高表達，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮類似于致癌基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤中，過表達的miRNA-221可以靶向作用于重要的腫瘤抑制基因如P27/Kip1、P57、Puma、ER-α、FOXO3、PTEN、TIMP3、DDIT4、Bim，繼而激活細胞周期和AKT旁路或阻斷TNF相關凋亡誘導配體（TRAIL），誘導腫瘤增殖和侵襲；而在舌鱗癌和甲狀腺癌中，miRNA-221也可以作用c-Kit或 MMP1抑制腫瘤增殖，起著抑癌miRNA的作用[6]。此外Garofalo等[17,18]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中過表達的miRNA211可以靶向結合抑癌基因PTEN和TIMP3，通過激活AKT旁路和金屬鈦酶從而誘導TRAIL抵抗和促進肺癌細胞的增殖、遷移和浸潤。這些發(fā)現(xiàn)提示了miRNA-221在肺癌中可能起著關鍵的作用。

表 1 miRNA-221表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關系Tab 1 Correlation of miRNA-221 expression and the clinical characteristics of 117 NSCLC patients

表 2 NSCLC患者總生存期單因素及多因素Cox回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate analyses of overall survival (OS) of 117 NSCLC patients

圖 1 不同miRNA-221表達水平NSCLC患者的生存分析Fig 1 Survival analysis of different miRNA-221 expression in NSCLC patients

本研究回顧分析了我院117例NSCLC患者的臨床資料，并采用RT-PCR方法對上述肺癌患者組織標本中miRNA-221的表達水平進行檢測，應用Kaplan-Meier法研究miRNA-221在NSCLC預后方面的意義。結果發(fā)現(xiàn)，117例NSCLC患者的臨床病理資料中，miRNA-221表達與性別、病理類型及分期、吸煙史等無明顯相關；卡方分析提示miRNA-221表達量與患者年齡相關，而Cox單變量和多變量分析表明總生存期與年齡無關，可以認為miRNA-211表達與年齡相關沒有臨床意義。Cox風險比例模型單因素分析顯示miRNA-221高表達與NSCLC患者預后呈明顯相關，多因素分析表明miR-221高表達（P=0.005）是NSCLC患者預后的獨立危險因素。而生存分析提示miRNA-221表達與患者總生存期呈負相關，即微小RNA-221表達水平高的患者生存時間較短。以上結果表明miRNA-221可能是NSCLC預后的一個重要指標。

本研究為回顧性研究，臨床資料不夠完善，例如缺少瘤旁組織和腫瘤組織的對照。對于肺癌患者的分組也可以更加地嚴格和精確，比如針對更細致的病理分期或分化程度進行分組。

綜上所述，miRNA-221高表達提示NSCLC預后較差，miRNA-221可作為NSCLC預后的一個重要分子標志。未來值得進一步開展嚴格的前瞻性臨床研究進一步證實該結果的可靠性。